干細胞對小鼠涎腺放射損傷的預防實驗研究.pdf

1、【背景】
　　唾液是人體生存所不可缺少的,由人體涎腺所分泌,它能幫助人體消化食物,殺菌、清潔和保護口腔。然而對于頭頸部惡性腫瘤患者,大部分要接受放療,而涎腺也位于頭頸部,這就不可避免的造成涎腺細胞不可逆性放射損傷,導致其分泌功能降低或喪失,給患者帶來極大的困擾,目前防止涎腺損傷的方法也只能是盡量減少腺體受到照射。而對于涎腺區(qū)腫瘤,部分放射損傷是不可避免的,目前在臨床上對于涎腺損傷尚沒有根本性的治療措施,如何從根本上預防涎腺放射損傷

2、,為病人解決痛苦呢,這成為目前廣大學者及醫(yī)生的難題。隨著組織工程研究的日益豐富,涎腺組織工程技術也逐漸發(fā)展起來,種子細胞是組織工程的重要因素,涎腺細胞屬于成熟的終末分化細胞,不能無限增殖,對于涎腺損傷的患者涎腺干細胞提取困難,隨著干細胞的多向分化潛能逐漸被發(fā)掘出來,其他來源的成體干細胞能否也應用于涎腺損傷的研究呢?因此本實驗探討用脂肪干細胞(adipose-derivedstemcells,ASCs)及骨髓干細胞(bonemesench

3、ymalstemcells,BMSCs)來預防涎腺放射損傷,研究其作用機制,為臨床預防患者口干癥狀提供一種新的思路。
　　【目的】
　　探討干細胞預防涎腺放射損傷的可行性,為應用于臨床預防放療患者口干癥狀提供實驗依據(jù)。
　　【方法】
　　1.從雄性小鼠中分離培養(yǎng)脂肪干細胞(ASCs)及骨髓干細胞(BMSCs),通過活細胞照相及HE染色,細胞成脂和成骨誘導分化,細胞生長曲線測定,以細胞表面CD分子測定,對干細胞特性

4、進行鑒定。
　　2.小鼠涎腺放射損傷模型的建立。將雌性小鼠分為6組,每組10只,瓦里安直線加速器分別進行對每組小鼠給予0Gy,12Gy,15Gy,18Gy,21Gy,24Gy進行頭頸部局部照射,照射后一月內觀察小鼠體重變化,照射后一周,一個月進行血象分析,照后2,3,4月進行唾液流量測定,組織切片HE染色,透射電鏡觀察組織超微結構,TUNEL法細胞凋亡檢測。
　　3.干細胞預防小鼠涎腺放射損傷實驗。分為四組,對照組(cont

5、rol),照射+生理鹽水(IR+NS),照射+脂肪干細胞(IR+ASCs),照射+骨髓干細胞(IR+BMSCs)。選取兩種第三代干細胞對照射后各組小鼠立即進行尾靜脈注射,每周兩次,每次注射細胞濃度為2×105/ml,每次注射0.2ml,連續(xù)注射8周,注射后8周進行檢測指標。
　　4.各組小鼠的涎腺功能測定:包括體重測量,腺體重量測量,唾液流量的測定。
　　5.各組小鼠的涎腺組織形態(tài)學觀察,包括HE染色,PAS染色,透射電鏡觀

6、察組織超微結構,TUNEL法細胞凋亡檢測組織損傷情況。
　　6.統(tǒng)計學分析方法,采用SPSS19.0軟件,采用ANOVA單因素方差分析法和t檢驗對上述采集的數(shù)據(jù)進行各組間統(tǒng)計分析,比較各組間有無統(tǒng)計學差異。
　　【結果】
　　1.從小鼠體內分離培養(yǎng)的ASCs,形態(tài)呈梭形,具有較強的增殖能力,能表達脂肪干細胞CD29、CD44和CD90,不表達CD31、CD34和CD45,能向成脂細胞和成骨細胞分化能力,表明實驗成功培養(yǎng)

7、出ASCs。
　　2.用全骨髓法成功從小鼠體內培養(yǎng)出骨髓間充質干細胞,細胞形態(tài)呈梭形,多邊形,三角形及不規(guī)則形,細胞表達CD29、CD44和CD90,不表達CD31、CD34和CD45，有向成脂及成骨分化的潛能,有自我更新和增殖能力,但沒有脂肪干細胞增殖能力強。
　　3.照射組小鼠在照射后體重輕微下降,血常規(guī)各項較對照組下降,唾液流量率較對照組有明顯下降,而且隨時間延長,照射劑量越大,降低幅度也越大,各照射組的唾液流量與未照

8、射組相比有明顯差異。
　　4.組織切片HE顯示照射組頜下腺組織較對照組有明顯損傷,腺泡細胞數(shù)量減少,結構紊亂,劑量越大,損傷越明顯;電鏡下可見腺泡細胞水腫變性壞死,細胞結構紊亂;凋亡檢測可見照射組組織大量凋亡細胞,18Gy照射組的凋亡率為21±2.5％,正常組織凋亡細胞幾乎為0。
　　5.干細胞注射后8周,進行指標檢測,IR+ASCs組,IR+BMSCs組較IR+NS組在小鼠體重、腺體重量及唾液流量上都稍增加,但較未照射組偏

9、低,IR+ASCs組較IR+BMSCs組稍增加,各組之間有明顯統(tǒng)計學差異。
　　6.細胞注射后8周,不同組的HE染色結果顯示:照射組腺泡細胞數(shù)量較未照射組減少,各組之間有統(tǒng)計學差異,注射細胞組較注射NS組細胞數(shù)量稍增加。
　　7.PAS染色同樣可見照射組較對照組組織切片染色較淺,而IR+注射細胞組較IR+NS組顏色稍深,可見照射組腺泡細胞的糖原明顯減少,而注射細胞組較注射NS組糖原成分稍增加。
　　8.透射電鏡觀察組織

10、超微結構顯示:對照組細胞形態(tài)正常,細胞器結構完好,而IR+NS組細胞水腫,細胞器破壞最嚴重,結構消失,溶酶體明顯增加,注射細胞組細胞形態(tài)基本正常,能見到新生的小血管。
　　9.各組織細胞凋亡檢測:從各凋亡切片可見:對照組幾乎為0,IR+NS組凋亡最明顯,凋亡指數(shù)為:38±2.3%,IR+ASCs組的凋亡指數(shù)為23±1.8%,IR+BMSCs組凋亡指數(shù)為28±2.1%,注射細胞能降低照射后組織的細胞凋亡率,差異有明顯統(tǒng)計學意義(P<

11、0.05)。
　　【結論】
　　1.從小鼠體內可以成功分離出脂肪干細胞及骨髓間充質干細胞,具有多向分化潛能,實驗證明骨髓間充質干細胞沒有脂肪干細胞增殖能力強。
　　2.頜下腺放射損傷有劑量依賴性,照射后兩個月,18Gy照射組組織切片有大量炎性細胞浸潤,與正常對照組相比,放射組小鼠下頜下腺的唾液流量降低接近正常組的60%,是研究涎腺放射損傷的理想的放射模型。
　　3.照射后注射干細胞組的涎腺組織無論在功能上和形態(tài)學