體細(xì)胞重編程過(guò)程中Pkm2表達(dá)特征和功能研究.pdf

1、目的:
　　癌癥是世界嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的數(shù)據(jù)顯示，每年全球約800萬(wàn)人死于癌癥。在我國(guó)每6分鐘就有一人被確診為癌癥，每天有8550人成為癌癥患者。因此，深入認(rèn)識(shí)癌癥并尋找診斷治療癌癥的靶標(biāo)刻不容緩。
　　生物體的生存離不開能量的供應(yīng)，腫瘤細(xì)胞也不例外。惡性腫瘤在有氧環(huán)境下仍然保持異常旺盛的糖酵解（Warburg效應(yīng)），這種代謝的轉(zhuǎn)變是為了滿足腫瘤增殖活力和生物合成的需求，其中一個(gè)起重要作用的關(guān)鍵酶便

2、是丙酮酸激酶，其與多種腫瘤的分期分型、惡性程度等密切相關(guān)。但在腫瘤發(fā)生早期，Pkm2是如何發(fā)揮作用的，其復(fù)雜的表達(dá)調(diào)控是如何建立的尚不清楚。這是由于腫瘤發(fā)生的過(guò)程不能夠被人們捕捉的原因。
　　隨著對(duì)腫瘤各方面性質(zhì)的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤與干細(xì)胞存在密切聯(lián)系，如Wnt、Notch、SHH等信號(hào)通路的相似性，ES特異基因Oct4、Sox2、Nanog等在腫瘤中同樣高表達(dá)等。因此，我們擬把重編程過(guò)程作為模擬腫瘤發(fā)生的體外研究平臺(tái)，研究P

3、km2在重編程過(guò)程中的表達(dá)模式及功能，探討其對(duì)重編程過(guò)程的影響和調(diào)控，為揭示Pkm2在腫瘤發(fā)生中的表達(dá)調(diào)控并發(fā)現(xiàn)新的潛在診療靶標(biāo)提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　首先，我們利用構(gòu)建成功的二次重編程系統(tǒng)小鼠制備小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF細(xì)胞）。然后利用MEF細(xì)胞在含有強(qiáng)力霉素(Dox)的ES培養(yǎng)基中誘導(dǎo)重編程，成功得到誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPS cell)。隨后，利用shRNA將Pkm敲低后進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察克隆生成情況。
　　

4、為了檢測(cè)重編程過(guò)程中Pk基因的表達(dá)變化，我們?cè)谡T導(dǎo)過(guò)程中在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣，用qPCR和Western Blot分別檢測(cè)Pkm1，pkm2的表達(dá)情況，對(duì)它們的表達(dá)變化進(jìn)行分析。最后，通過(guò)qPCR檢測(cè)Pkm2的相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)。
　　根據(jù)已知的Pkm2基因在腫瘤細(xì)胞中的調(diào)控情況，探尋在腫瘤細(xì)胞中相關(guān)調(diào)控基因Ptb，hnRANPA1，hnRNPA2B1，Hif-1α等在重編程過(guò)程中的表達(dá)趨勢(shì)。然后對(duì)它們進(jìn)行上調(diào)或者敲低表達(dá)后，觀察其

5、對(duì)重編程過(guò)程的影響及對(duì)Pkm2、Pkm1基因的調(diào)控作用。
　　Pk基因的幾種亞型中，只有Pkm2能夠被變構(gòu)調(diào)節(jié):低激酶活性的二聚體形式和高激酶活性的四聚體形式。在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)Pkm2二聚體形式，而高激酶活性的Pkm2四聚體形式表達(dá)較低。我們將利用Western Blot檢測(cè)在重編程過(guò)程中Pkm2兩種變構(gòu)形式的變化關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1、Pkm2在重編程過(guò)程中起到重要作用，不可或缺;
　　2、Pkm2在多能