分化過程中Pkm2的表達(dá)特征及指示Pkm2表達(dá)的報(bào)告系統(tǒng)的建立.pdf

1、目的：
　　1、探究基因Pk(Pyruvate Kinase)在小鼠胚胎干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及小鼠各個(gè)組織器官的表達(dá)情況，驗(yàn)證M2型丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase SubtypeM2 Pkm2)在小鼠胚胎干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中高表達(dá)。
　　2、探究ES細(xì)胞中及重編程過程中癌基因Pkm2，與Pkm2表達(dá)調(diào)控相關(guān)的部分基因的表達(dá)情況。探究分化過程中與分化相關(guān)的三個(gè)胚層基因的表達(dá)變化，Pkm2，Pkm1，多能性基因Na

2、nog，Oct4及與Pkm2表達(dá)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)變化，進(jìn)一步驗(yàn)證干細(xì)胞與Pkm2的相互關(guān)系。
　　3、胚胎干細(xì)胞中能夠指示Pkm2表達(dá)的紅色熒光報(bào)告系統(tǒng)的建立。
　　4、利用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)及能夠指示Pkm2表達(dá)的紅色熒光報(bào)告系統(tǒng)，篩選出對Pkm2的表達(dá)起調(diào)控作用的新基因、新蛋白，并進(jìn)一步研究該基因及蛋白與Pkm2的相互作用及在重編程過程中的功能。
　　方法：
　　第一，得到由C57BL/6小鼠制備的小鼠成纖維細(xì)胞(

3、Mouse EmbryonicFibroblasts，MEF)，來源于129系小鼠的胚胎干細(xì)胞R1及由MEF誘導(dǎo)來的多能干細(xì)胞LiPS-37，然后分別提取C57BL/6小鼠的各個(gè)組織、器官，通過實(shí)時(shí)定量PCR的方法，檢測這些小鼠特定的組織、器官及MEF、R1、LiPS-37等細(xì)胞系中Pk三個(gè)同工酶(Pkm1、Pkm2、Pklr)的表達(dá)情況。同時(shí)，檢測ES及重編程過程中Pkm2及與Pkm2表達(dá)調(diào)控相關(guān)的基因的表達(dá)情況，另外在小鼠胚胎干細(xì)胞

4、R1中進(jìn)行維甲酸(Retinoic Acid，RA)、去除白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor，LIF)和除去飼養(yǎng)細(xì)胞(Feeder Cell)或者是促進(jìn)擬胚體(Embryoid Body，EB)的形成等處理，使得R1分化，觀察在分化過程中基因Pkm1和Pkm2，多能性基因Nanog和Oct4，與胚胎發(fā)育相關(guān)的三個(gè)胚層的基因Pax6、Foxa2、Gata6的表達(dá)變化，以及與Pkm2調(diào)控相關(guān)的部分基因的表達(dá)

5、變化。
　　第二，借助于CRISPR/Cas9系統(tǒng)及同源重組的方法，根據(jù)小鼠胚胎干細(xì)胞染色體癌基因Pkm2的基因序列設(shè)計(jì)sgRNA及兩個(gè)特定的同源臂，將能夠編碼紅色熒光蛋白(Red Fluorescent Protein，RFP)的基因克隆到兩個(gè)特定的同源臂之間，構(gòu)建指示癌基因Pkm2紅色熒光蛋白表達(dá)的載體，然后將這種載體瞬轉(zhuǎn)到小鼠胚胎干細(xì)胞R1細(xì)胞系中，Cas9復(fù)合體能夠通過向?qū)蛄?guide sequence)與DNA靶位點(diǎn)

6、結(jié)合，在sgRNA存在的情況下，RFP會(huì)特異性的并插入到小鼠胚胎干細(xì)胞染色體Pkm2基因的特定位置，可以用來指示Pkm2在小鼠胚胎干細(xì)胞R1細(xì)胞系的表達(dá)情況，并且將得到的該細(xì)胞系進(jìn)行分化處理，直接觀察紅色熒光的亮度變化。
　　第三，利用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入基因組的方法，在該指示Pkm2表達(dá)的紅色熒光細(xì)胞系中篩選出能夠?qū)τ诩t色熒光有影響的新基因、新蛋白，并進(jìn)一步研究新基因、新蛋白與Pkm2的相互關(guān)系及在重編程過程中的功能。
　　結(jié)果

7、和結(jié)論：
　?。ㄒ唬┌┗騊km2的特異性表達(dá)及在分化、重編程過程中發(fā)揮著重要作用
　　癌基因Pkm2特異性在小鼠胚胎干細(xì)胞R1、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞LiPS-37中表達(dá)量較高，并且Pkm2在重編程過程中表達(dá)逐漸增高，在分化過程中表達(dá)逐漸降低。
　?。ǘ┙⒓t色熒光蛋白指示Pkm2表達(dá)的報(bào)告系統(tǒng)及陽性細(xì)胞系的純化及擴(kuò)增建系
　　運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)及同源重組的方法，將sgRNA及同源臂導(dǎo)入到癌基因Pkm2表