抑制PKM2的siRNA協(xié)同抑制CCND1的作用機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 抑制PKM2的siRNA協(xié)同抑制CCND1的作用機(jī)制研究
　　目的:研究siM2PK-1分子對(duì)CCND1表達(dá)的抑制作用并探討其機(jī)制。方法:通過克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)siM2PK-1分子對(duì)于肝癌細(xì)胞增殖與周期的影響,利用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)siM2PK-1分子對(duì)于CCND1的表達(dá)的影響,過表達(dá)PKM2及利用其它針對(duì)PKM2的干涉實(shí)驗(yàn)確定siM2PK-

2、1對(duì)于CCND1抑制作用的特異性,生物信息學(xué)分析及報(bào)告基因檢測(cè)初步探究了siM2PK-1抑制CCND1表達(dá)的機(jī)制。結(jié)果:克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)siM2PK-1分子對(duì)于SK-Hep-1細(xì)胞具有抑制增殖的作用,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)siM2PK-1可以引起細(xì)胞周期阻滯于G0-G1期,實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot證實(shí)siM2PK-1分子對(duì)于CCND1的表達(dá)在mRNA水平和蛋白水平都有影響,過表達(dá)PKM2分子不能引起CCND1分子在mRNA和

3、蛋白水平的上調(diào)表達(dá),而利用其他的針對(duì)PKM2分子的siRNA也不能使CCND1的表達(dá)下調(diào),進(jìn)而得出siM2PK-1分子具有雙靶向作用,而進(jìn)一步利用生物信息學(xué)分析結(jié)合報(bào)告基因確定siM2PK-1可能通過不完全互補(bǔ)的模式與CCND1分子啟動(dòng)子區(qū)的序列結(jié)合進(jìn)而引起其啟動(dòng)子區(qū)的CpG島的甲基化。結(jié)論:抑制PKM2的siM2PK-1分子具有協(xié)同抑制CCND1分子表達(dá)的作用。
　　第二部分 缺氧與miRNA表達(dá)關(guān)系的研究
　　目的:探討

4、不同缺氧條件對(duì)HepG2細(xì)胞中miR-210表達(dá)水平的影響。方法:采用CoCl2、物理缺氧以及Na2SO3三種不同的缺氧條件誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞,利用實(shí)時(shí)定量 PCR技術(shù)檢測(cè)不同缺氧模式誘導(dǎo)前后HepG2細(xì)胞miR-210等表達(dá)變化。
　　結(jié)果:三種缺氧模式均可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞miR-210表達(dá)上調(diào),其表達(dá)與CoCl2及Na2SO3的濃度有劑量依賴關(guān)系。結(jié)論:CoCl2、物理缺氧以及Na2SO3三種不同的缺氧條件均可以有效誘導(dǎo)H