IDH3α對肺腺癌糖代謝影響機(jī)制及其抑制劑TBT協(xié)同抗腫瘤作用研究.pdf

1、目的:肺癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，是影響我國居民健康的主要惡性腫瘤，其發(fā)病和死亡率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，肺腺癌是肺癌中最常見的病理類型，最常用的治療方式是手術(shù)及化療。該腫瘤進(jìn)展迅速，容易轉(zhuǎn)移以及化療耐藥是目前治療面臨的難題，能夠反映腫瘤生物學(xué)行為的分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用對該腫瘤的治療有潛在的應(yīng)用價(jià)值。腫瘤的糖代謝重編碼是指腫瘤細(xì)胞ATP的主要生成方式由葡萄糖氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)轉(zhuǎn)換為有氧糖酵解

2、(aerobic glycolysis)，這是大部分惡性腫瘤的特征改變;同時(shí)，細(xì)胞糖代謝異常（關(guān)鍵酶基因突變，關(guān)鍵酶或代謝生成物增加或減少等）可導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生;異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）是三羧酸循環(huán)的限速酶，負(fù)責(zé)催化異檸檬酸氧化脫羧形成α-酮戊二酸;研究證實(shí)IDH1/2酶基因突變可導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤及急性白血病的發(fā)生;近期有研究發(fā)現(xiàn)其同工酶IDH3（又稱NAD-IDH）的α催化亞基在惡性腫瘤中

3、高表達(dá)（肺癌、乳腺癌、肝癌），在腫瘤細(xì)胞糖代謝重編碼中發(fā)揮著重要的作用。本研究旨在研究IDH3α與腫瘤糖代謝關(guān)系及其影響糖代謝的機(jī)制，初步探討靶向IDH3α的抑制劑三丁基錫抗腫瘤能量代謝治療價(jià)值。
　　研究方法:1.通過納入術(shù)前行18氟-氟代脫氧葡萄糖(18F-Fluorodeoxyglucose，18F-FDG)正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層掃描（positron emission tomography/computedtomograp

4、hy，PET/CT）顯像，且術(shù)后病理確診為肺腺癌的患者病灶石蠟標(biāo)本切片65例，利用免疫組化染色檢測IDH3α、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glucose transporter1，GLUT1)和己糖激酶2(hexokinase2，HK2)在肺腺癌患者病灶中的表達(dá)，分析IDH3α表達(dá)與18F-FDG PET/CT顯像中反映糖代謝的半定量指標(biāo)最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值(maximum standard uptake value，SUVmax)，腫瘤代謝體積(me

5、tabolic tumorvolume，MTV)和病灶糖酵解總量(total lesion glycolysis，TLG)及GLUT1和HK2表達(dá)的相關(guān)性，來探討肺腺癌IDH3α表達(dá)與有氧糖酵解的關(guān)系。2.在細(xì)胞水平采用A549和H1299肺腺癌細(xì)胞系，利用化學(xué)合成的siRNA干擾IDH3α表達(dá)，利用Real-time PCR檢測IDH3α下調(diào)后GLUT1和HK2 mRNA的表達(dá);利用Western blot檢測IDH3α下調(diào)后磷酸化絲

6、氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(phosphorylated serine threonine kinase，p-AKT)，GLUT1和HK2蛋白的表達(dá);利用γ計(jì)數(shù)器檢測IDH3α下調(diào)后18F-FDG攝取改變;利用液閃儀檢測IDH3α下調(diào)后3H-DG摻入的改變;利用JC-10檢測IDH3α下調(diào)后線粒體膜電位的改變;通過檢測ATP的生成及培養(yǎng)基中的乳酸來反映IDH3α下調(diào)后糖代謝產(chǎn)物的改變。3.進(jìn)一步探討IDH3α抑制劑三丁基錫(tributylt

7、in，TBT)在肺腺癌細(xì)胞順鉑化療中的協(xié)同價(jià)值，通過CCK8法確定TBT及常用肺癌化療藥物順鉑對A549肺腺癌細(xì)胞的半抑制濃度(half-inhibitory concentration，IC50)，根據(jù)獲得的IC50濃度，通過與正常對照組比較，檢測異檸檬酸脫氫酶活性驗(yàn)證TBT是否能降低異檸檬酸脫氫酶活性;將TBT IC50和1/2 IC50同順鉑的1/2 IC50進(jìn)行組合，分為TBT IC50+順鉑1/2 IC50，TBT1/2 IC

8、50+順鉑1/2 IC50組，分別與單藥組和對照組比較，利用γ計(jì)數(shù)器檢測18F-FDG攝取及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡改變;利用IC50檢測確定A549肺腺癌細(xì)胞中加入1/2 IC50 TBT后順鉑IC50變化，以探討TBT協(xié)同順鉑抑制腫瘤細(xì)胞增值的價(jià)值。
　　結(jié)果:1.根據(jù)免疫組化染色I(xiàn)DH3α表達(dá)評分，將65例患者分為高表達(dá)組31例和低表達(dá)組34例，高表達(dá)組SUVmax、MTV和TLG分別為8.0±5.0、5.5±5.3和22.1

9、±21.2，低表達(dá)組SUVmax、MTV和TLG分別5.4±3.8、3.0±2.1和9.3±9.1，兩組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，IDH3α表達(dá)與GLUT1表達(dá)具有相關(guān)性(P＜0.05)。2.利用化學(xué)合成的siRNA干擾A549和H1299肺腺癌細(xì)胞IDH3αmRNA表達(dá)，通過Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)染成功。利用Real-time PCR檢測IDH3α下調(diào)后GLUT1和HK2 mRNA的表達(dá)，結(jié)

10、果顯示:沉默IDH3α表達(dá)后能夠降低GLUT1的mRNA的表達(dá)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而HK2的表達(dá)未見明顯變化;利用Western blot檢測IDH3α表達(dá)下調(diào)后p-AKT，GLUT1和HK2蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示p-AKT，GLUT1蛋白表達(dá)下調(diào)，而HK2蛋白表達(dá)未見明顯變化;利用γ計(jì)數(shù)器檢測IDH3α下調(diào)后18F-FDG攝取改變，結(jié)果顯示:IDH3α表達(dá)下調(diào)后，處理組18F-FDG攝取較正常對照組有明顯降低，結(jié)果具有

11、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);利用液閃儀檢測IDH3α下調(diào)后3H-DG攝取改變，結(jié)果顯示:IDH3α表達(dá)下調(diào)后，處理組3H-DG攝取較正常對照組有明顯降低，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);利用JC-10檢測IDH3α下調(diào)后線粒體膜電位的改變，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示與對照組相比，沉默組線粒體膜電位有一定的下降，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。通過檢測ATP的生成及培養(yǎng)基中的乳酸來反映IDH3α下調(diào)后糖代謝產(chǎn)物的改變，結(jié)果顯示培養(yǎng)基中

12、的乳酸的生成有明顯的降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，而ATP的生成則無明顯變化。3.通過細(xì)胞半數(shù)抑制濃度測定確定TBT抑制A549生長的IC50為300.1±12 nM，順鉑抑制A549生長的IC50為39.7±0.5μM;通過異檸檬酸脫氫酶活性檢測證實(shí)TBT確實(shí)能降低異檸檬酸脫氫酶活性，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;將TBT150 nM和300 nM同順鉑的20μM進(jìn)行組合，分為TBT150 nM+順鉑20μM組

13、和TBT300 nM+順鉑20μM組，將聯(lián)合用藥組及單藥組與對照組比較，利用γ計(jì)數(shù)器檢測18F-FDG攝取結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組及單藥組較對照組18F-FDG均有明顯降低，流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡發(fā)生率均有明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;利用IC50檢測確定A549肺腺癌細(xì)胞中加入TBT150 nM后順鉑IC50變化，結(jié)果顯示TBT降低順鉑使用量IC50為27.3±0.4μM。
　　結(jié)論:肺腺癌高表達(dá)IDH3α者較低表