重組CD13單鏈抗體-蝎毒素AGAP融合蛋白的原核表達(dá)及其對(duì)NB4細(xì)胞的作用.pdf

1、目的： 本研究應(yīng)用基因工程技術(shù)方法，構(gòu)建CD13單鏈抗體/蝎毒素AGAP融合基因的原核表達(dá)載體pRSETA/AGAP/CD13scFv，在原核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)并純化重組目的蛋白，并通過體外實(shí)驗(yàn)觀察該重組蛋白對(duì)CD13陽性腫瘤細(xì)胞株NB4的作用。 方法： 1.構(gòu)建pRSETA/AGAP/CD13scFv、pRSETA/cD13scFv重組表達(dá)載體：利用RT-PCR法從東亞鉗蝎尾腺中獲得AGAP目的基因，用TA克

2、隆法將目的基因連接至克隆載體PCR-TOPO，用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定克隆載體PCR-TOPO/AGAP及測(cè)序進(jìn)一步鑒定AGAP序列正確性；再經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后克隆至表達(dá)載體pRSETA，PCR初步鑒定重組表達(dá)載體pRSETA/AGAP，EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定pRSETA/AGAP，最后測(cè)序進(jìn)一步鑒定pRSETA/AGAP序列的正確性；以質(zhì)粒pSecTag2HygroC為模板，PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的片段CD

3、13scFv，將PCR產(chǎn)物膠回收純化后進(jìn)行測(cè)序鑒定CD13scFv序列的正確性，再經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后克隆至重組表達(dá)載體pRSETA/AGAP，PCR初步鑒定重組表達(dá)載體pRSETA/AGAP/CD13scFv，EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定pRSETA/AGAP/CD13scFv，最后測(cè)序進(jìn)一步鑒定pRSETA/AGAP/CD13scFv序列的正確性。再用與pRSETA/AGAP同樣的方法構(gòu)建pRSETA/CD13scFv重

4、組表達(dá)載體。 2.pRSETA/AGAP/CD13scFv、pRSETA/CD13scFv重組表達(dá)載體在原核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)、鑒定及純化：將pRSETA/AGAP/CD13scFv、pRSETA/CD13scFv重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，加用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)CD13scFv/AGAP融合蛋白及CD13單鏈抗體蛋白，超聲裂解細(xì)菌提取蛋白質(zhì)，并進(jìn)一步用ProBondTMNickel-Chelating Re

5、sin純化柱結(jié)合并純化融合蛋白CD13scFv/AGAP及CD13單鏈抗體蛋白，通過SDS-PAGE、Western Blot分析制備目的蛋白。 3.融合蛋白CD13scFv/AGAP在體外對(duì)CD13陽性腫瘤細(xì)胞株NB4的作用：將融合蛋白CD13scFv/AGAP與CD13陽性白血病細(xì)胞株NB4細(xì)胞共同培養(yǎng)，在顯微鏡下觀察NB4細(xì)胞株生長(zhǎng)狀態(tài)；CCK-8檢測(cè)融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞NB4的生長(zhǎng)抑制率，并與對(duì)照組比較(Raji細(xì)胞組、

6、CD13單鏈抗體蛋白組)抑制率；AnexinV法經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞NB4的凋亡情況；PI染色法經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)融合蛋白CD13scFv/AGAP對(duì)NB4白血病細(xì)胞株細(xì)胞周期的影響。 結(jié)果： 1、重組原核表達(dá)載體pRSETA/AGAP/CD13scFv、pRSETA/CD13scFv經(jīng)測(cè)序其目的片段分別與理論預(yù)計(jì)一致。 2、重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌后，加入0.5mM IPTG37℃誘導(dǎo)4小

7、時(shí)后，通過SDS-PAGE電泳、Werstern Blot分析外源蛋白的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物即CD13scFv/AGAP融合蛋白、CD13單鏈抗體蛋白均主要以不溶性的包涵體形式存在。 3、融合蛋白CD13scFv/AGAP在體外與CD13陽性的白血病細(xì)胞株NB4共同培養(yǎng)后，在顯微鏡下觀察NB4細(xì)胞株碎片增加，數(shù)量明顯減少；CCK-8顯示不同濃度的融合蛋白CD13scFv/AGAP作用于NB4細(xì)胞后，能夠明顯抑制NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)，且其

8、作用在一定范圍內(nèi)呈對(duì)濃度和時(shí)間的依賴性，其抑制率與對(duì)照組(Raji細(xì)胞組、CD13單鏈抗體蛋白組)相比明顯提高(P<0.01)；流式細(xì)胞術(shù)分析顯示融合蛋白CD13scFv/AGAP作用于NIM細(xì)胞后，凋亡率與對(duì)照組相比明顯升高(P<0.01)；流式細(xì)胞術(shù)分析還顯示融合蛋白CD13scFv/AGAP作用于NB4細(xì)胞后，細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期(P<0.01)，阻止其進(jìn)入S期及G2/M期。 結(jié)論： 1、通過分子克隆等技