基于聚乙烯亞胺的兩類基因遞送載體的構(gòu)建及其體內(nèi)外轉(zhuǎn)染特性研究.pdf

1、研究背景：
　　基因治療是一種通過載體將核酸、反義寡核苷酸或者小干擾RNA等基因藥物遞送到靶細(xì)胞內(nèi)，通過調(diào)控特定基因表達(dá)，達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)治療方法?；蛑委煵粌H可以用于遺傳性疾病的治療，而且可為預(yù)防和治療癌癥、病毒感染、糖尿病以及艾滋病等提供良好的方法，已成為生物醫(yī)學(xué)治療的重要組成部分?；蛑委煹某晒?shí)現(xiàn)離不開優(yōu)良的基因遞送載體，基因遞送載體主要分為病毒和非病毒載體。病毒載體的基因轉(zhuǎn)染效率較高，但是由于其負(fù)載基因片段大小

2、有限制，具有免疫原性，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，有可能產(chǎn)生插入突變以及可能引起嚴(yán)重的安全問題等，使其臨床應(yīng)用受到限制。非病毒載體生產(chǎn)成本相對(duì)較低，具有低的免疫原性和細(xì)胞毒性，可遞送較大片段的基因等許多優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為基因遞送載體研究的熱點(diǎn)。
　　聚乙烯亞胺（Polyethyleneimine，PEI）是一種被廣泛研究的基因遞送非病毒載體，在不同細(xì)胞和轉(zhuǎn)染條件下展現(xiàn)出穩(wěn)定高效的基因轉(zhuǎn)染效果，其中PEI25k更被視作基因轉(zhuǎn)染的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。高

3、密度的伯胺、仲胺和叔胺基團(tuán)使得 PEI在較廣的 pH范圍內(nèi)具有顯著的緩沖能力，該特性被稱作“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，也是PEI高轉(zhuǎn)染活性的關(guān)鍵因素之一。雖然 PEI在基因遞送領(lǐng)域具有極為廣闊的應(yīng)用前景，但仍存在體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率低，細(xì)胞毒性大和溶酶體降解等亟需解決的問題。因此，以 PEI為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)構(gòu)建高效低毒的基因遞送載體具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。
　　研究目的：
　　綜合考慮基因治療和 PEI遞送載體的研究現(xiàn)狀，分別以線性和支化聚乙

4、烯亞胺為起始原料，設(shè)計(jì)并合成兩類新型遞送載體并用于基因轉(zhuǎn)染研究。第一類是以線性聚乙烯亞胺LPEI25k和α-環(huán)糊精為原料，制備得到超分子準(zhǔn)聚輪烷，并以2,4-二硝基苯甲醛作為封端基團(tuán)，合成得到酸敏封端和非酸敏封端的兩種新型聚輪烷，以期獲得高轉(zhuǎn)染效率和低毒性的基因遞送載體。第二類是以支化聚乙烯亞胺 BPEI25k為原料，制備得到甘露醇修飾的陽離子聚合物，通過甘露醇的引入增強(qiáng)小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑對(duì)基因載體的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，從而一定程度避免溶酶體

5、的降解，以期獲得高效低毒的基因遞送載體。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1、以 LPEI25k和α-環(huán)糊精為起始原料，通過主客體分子的包合作用得到準(zhǔn)聚輪烷L(zhǎng)PEI25k/CD，并以2,4-二硝基苯甲醛作為封端基團(tuán)，通過醛胺縮合得到酸敏基團(tuán)席夫堿封端的聚輪烷L(zhǎng)PEI25k/CD-PA，繼而使用氰基硼氫化鈉對(duì)席夫堿進(jìn)行還原，得到非酸敏基團(tuán)封端的聚輪烷L(zhǎng)PEI25k/CD-PB。以BPEI25k為起始原料，通過還原胺化反應(yīng)制備得到4種不同取

6、代度甘露醇修飾的陽離子聚合物基因載體。通過核磁共振氫譜、紅外光譜和元素分析對(duì)合成中間體和載體材料結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。
　　2、通過凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)測(cè)定上述兩類載體材料對(duì)pDNA的復(fù)合能力；采用納米粒度和Zeta電位分析儀對(duì)載體材料/pDNA復(fù)合物的粒徑、PDI和Zeta電位進(jìn)行表征；利用流式細(xì)胞儀以及熒光顯微鏡，以表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白的pEGFP為遞送基因，以基因轉(zhuǎn)染的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”PEI25k作為陽性對(duì)照，在HEK293T細(xì)胞評(píng)價(jià)所合成的7

7、種基因遞送載體材料的體外轉(zhuǎn)染活性，并且在血清存在下對(duì)優(yōu)選的基因遞送載體材料的轉(zhuǎn)染活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)；使用MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)優(yōu)選的2種基因遞送載體材料的毒性進(jìn)行測(cè)定。
　　3、通過3種特異性的內(nèi)吞途徑抑制劑對(duì)優(yōu)選載體材料 LPEI25k/CD和BPEI25k-man-L的入胞機(jī)制進(jìn)行研究。以14位酪氨酸磷酸化小窩蛋白-1表達(dá)作為檢測(cè)指標(biāo)，采用Western-blot實(shí)驗(yàn)，對(duì)甘露醇修飾的BPEI25k-man-L的內(nèi)吞介導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行研究。

8、　　4、以裸鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用尾靜脈注射的方法，以 pEGFP基因?yàn)閳?bào)告基因，觀察GFP在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)及分布情況，對(duì)優(yōu)選的載體材料進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染活性評(píng)價(jià)。結(jié)果與討論：
　　1、LPEI25k準(zhǔn)聚輪烷和聚輪烷基因遞送載體的構(gòu)建與評(píng)價(jià)
　?。?）經(jīng)核磁共振氫譜和紅外光譜鑒定，所合成的準(zhǔn)聚輪烷L(zhǎng)PEI25k/CD及聚輪烷L(zhǎng)PEI25k/CD-PA和LPEI25k/CD-PB均為目標(biāo)產(chǎn)物。
　?。?）LPEI25k/CD，LP

9、EI25k/CD-PA和LPEI25k/CD-PB/pDNA復(fù)合物的平均粒徑分別是384.9、175.4和162.6 nm，粒徑分布的多分散性指數(shù)分別是0.333、0.150和0.198，復(fù)合物的Zeta電位分別3.57、4.03和5.54 mV，三種材料都可以和pDNA形成規(guī)則球形并且荷正電的納米粒，可以用于基因的遞送研究。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)表明，3種載體都可以在重量比1:1時(shí)完全復(fù)合pDNA，其中準(zhǔn)聚輪烷L(zhǎng)PEI25k/CD可以在更低的重

10、量比1:2下與pDNA復(fù)合完全，具有和陽性對(duì)照LPEI25k相當(dāng)?shù)膹?fù)合能力，同時(shí)展現(xiàn)出比聚輪烷L(zhǎng)PEI25k/CD-PA和LPEI25k/CD-PB更好的復(fù)合能力。
　?。?）體外基因轉(zhuǎn)染活性研究結(jié)果表明，與LPEI25k相比，準(zhǔn)聚輪烷L(zhǎng)PEI25k/CD展現(xiàn)出與之相當(dāng)甚至較高的轉(zhuǎn)染活性，聚輪烷L(zhǎng)PEI25k/CD-PA和LPEI25k/CD-PB雖然展現(xiàn)出較低或相當(dāng)?shù)钠骄鶡晒鈴?qiáng)度，但是陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)較低。與酸敏鍵封端的LPEI2

11、5k/CD-PA相比，非酸敏鍵封端的LPEI25k/CD-PB在三種N/P下均表現(xiàn)出較低的陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度，表明酸敏鍵封端的聚輪烷比非酸敏鍵封端的聚輪烷表現(xiàn)出更好的轉(zhuǎn)染效率。在10％血清存在下，LPEI25k在N/P重量比10:1，20:1和50:1的情況下轉(zhuǎn)染效率均明顯的降低；但是對(duì)于LPEI25k/CD而言，在重量比為10:1時(shí)，陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度均與不加血清條件下的轉(zhuǎn)染效果相當(dāng)。而且，當(dāng)N/P重量比增至20:

12、1和50:1時(shí)，相對(duì)于LPEI25k，LPEI25k/CD的轉(zhuǎn)染受血清的影響較小，表現(xiàn)出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效率和體內(nèi)應(yīng)用前景。
　?。?）MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPEI25k/CD（IC50=30.7μg/mL）比LPEI25k（IC50=20.0μg/mL）表現(xiàn)出更低的毒性，具有更好的生物相容性和安全性。
　?。?）酶降解保護(hù)實(shí)驗(yàn)表明，LPEI25k/CD和LPEI25k都具有良好的pDNA保護(hù)能力。進(jìn)一步的基因釋放能力實(shí)驗(yàn)表明，與

13、 LPEI25k相比，LPEI25k/CD復(fù)合物中pDNA的解離釋放更為容易。
　　（6）內(nèi)吞途徑抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPEI25k/CD/pDNA復(fù)合物的主要入胞機(jī)制為網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑。
　?。?）體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPEI25k/CD/pDNA復(fù)合物單次給藥后可以在裸鼠體內(nèi)有效和持續(xù)地表達(dá)GFP，能夠高效遞送的主要器官依次為睪丸、腦、肝、肺、腎、脾臟和心臟。
　　2、BPEI25k陽離子聚合物基因遞送載體的

14、構(gòu)建與評(píng)價(jià)
　?。?）經(jīng)核磁共振氫譜和紅外光譜鑒定，所合成的4種 BPEI25k陽離子聚合物BPEI25k-man-S/L/M/H均為目標(biāo)產(chǎn)物。經(jīng)元素分析測(cè)定，BPEI25k-man-S/L/M/H中甘露醇的接枝度分別為20.8、47.0、56.2和171.1個(gè)。
　?。?）BPEI25k-man-S/L/M3種陽離子聚合物在四種N/P重量比下與pDNA形成的納米復(fù)合物的粒徑，PDI和Zeta電位與BPEI25k相當(dāng)，BPE

15、I25k-man-H的電位和BPEI25k相當(dāng)，但是其粒徑較大。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除了BPEI25k-man-H在N/P為1:1時(shí)與pDNA完全復(fù)合，BPEI25k-man-S/L/M3種陽離子聚合物均可以在低氮磷比N/P為1:2時(shí)與pDNA完全復(fù)合。4種陽離子聚合物均符合基因載體的基本要求，可以進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
　?。?）體外轉(zhuǎn)染結(jié)果表明，在低氮磷比N/P為1:2時(shí)，4種載體材料的轉(zhuǎn)染效率均低于BPEI25k（N/P為2:

16、1）；在N/P為2:1、5:1和10:1時(shí)，BPEI25k-man-L具有和對(duì)照相當(dāng)?shù)年栃赞D(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度，BPEI25k-man-S和 BPEI25k-man-M的陽性細(xì)胞數(shù)低于對(duì)照，但是平均熒光強(qiáng)度與之相當(dāng)，BPEI25k-man-H的陽性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度均低于對(duì)照。其中具有適度甘露醇接枝度的BPEI25k-man-L在N/P為2:1、5:1和10:1時(shí)均表現(xiàn)出和陽性對(duì)照相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染效率，可作為候選基因載體進(jìn)行進(jìn)一步的研究

17、。10%血清存在下的轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，對(duì)照BPEI25k在N/P重量比2:1時(shí)的陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)明顯降低，但是 BPEI25k-man-L的轉(zhuǎn)染活性與不加血清下的轉(zhuǎn)染效果相當(dāng)，表現(xiàn)出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效率和極好的體內(nèi)應(yīng)用前景。
　　（4）MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BPEI25k-man-L（IC50=31.4μg/mL）比陽性對(duì)照BPEI25k（IC50=15.3μg/mL）展現(xiàn)出更低的毒性，表現(xiàn)出更好的生物相容性和安全性。
　　（5）酶降解保

18、護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BPEI25k-man-L和陽性對(duì)照BPEI25k都具有良好的pDNA保護(hù)能力。
　?。?）內(nèi)吞途徑抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BPEI25k/pDNA復(fù)合物在 HEK293T細(xì)胞主要通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞入胞，其中，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑占稍大的比例；甘露醇修飾的BPEI25k-man-L/pDNA復(fù)合物在HEK293T細(xì)胞上可通過3種內(nèi)吞途徑入胞，主要通過小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞入胞。上述研究結(jié)果表明，對(duì)B

19、PEI25k進(jìn)行甘露糖醇修飾可改變BPEI25k的內(nèi)吞途徑，增強(qiáng)小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞。進(jìn)一步的 Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)由甘露醇修飾后的基因載體BPEI25k-man-L可激活Src酪氨酸激酶誘導(dǎo)的小窩蛋白-1的磷酸化，刺激小窩的形成和從質(zhì)膜脫落入胞，從而增強(qiáng)小窩蛋白途徑介導(dǎo)的基因載體入胞。
　?。?）體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BPEI25k-man-L/pDNA復(fù)合物單次給藥即可展示很好的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果，可以在體內(nèi)持續(xù)地

20、表達(dá) GFP，能夠高效遞送的主要器官依次為腦、睪丸、肝、腎、肺、心臟和脾臟。
　　結(jié)論：
　　本文設(shè)計(jì)合成了兩類7種基于PEI的準(zhǔn)聚輪烷和聚輪烷及陽離子聚合物基因載體，并對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征、體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染活性和入胞機(jī)制的研究。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，所得7種基因載體材料均為目標(biāo)產(chǎn)物。兩類載體材料中準(zhǔn)聚輪烷L(zhǎng)PEI25k/CD和甘露醇修飾的 BPEI25k-man-L轉(zhuǎn)染效果最好，表現(xiàn)出高效低毒的特性。入胞途徑研究結(jié)果顯示，LPEI