高山離子芥線粒體交替途徑介導的抗寒特征研究.pdf

1、高山離子芥是一種典型的高海拔寒區(qū)適應性物種，生長于海拔3800米以上的冰緣地帶，整個生活周期受到寒冷，強紫外輻射和低氧分壓的影響。高山離子芥不具備特殊的形態(tài)學特征來抵御寒冷脅迫，體內細胞活動承擔了主要的防御能力。線粒體是一個重要的產能細胞器，植物線粒體具有多種交替途徑所介導的能量耗散系統，主要包括末端交替氧化酶途徑，解偶聯途徑和交替NAD(P)H脫氫酶途徑。雖然已經有很多的研究發(fā)現這些途徑參與了植物的抗逆過程，但是對于高山離子芥的相關研

2、究尚屬空白。本論文以高山離子芥為材料，研究了冷脅迫時的植物線粒體抗性特征及線粒體交替途徑在抗寒中的作用特征。同時，研究了參與植物線粒體交替型NAD(P)H脫氫途徑的蛋白質之間的相互作用與抗寒性的關系，從而深入了解該途徑在植物抗寒中的作用機制。取得了以下研究結果： 1．采用HPLC對高山離子芥懸浮細胞的泛醌氧化還原性水平在不同溫度處理下的變化進行了研究。結果表明早期低溫誘導下，細胞活性氧水平和線粒體功能保持正常，泛醌的氧化還原狀態(tài)

3、之間的轉變加劇，氧化性水平升高，這種氧化還原轉變使得泛醌發(fā)揮了其抗氧化活性，在高山離子芥細胞受到早期低溫脅迫誘導時可以降低隨之產生的活性氧的積累。 2．Western-blotting研究結果發(fā)現，高山離子芥不具備類似于其它植物的電子傳遞鏈末端交替氧化酶，KCN對細胞色素氧化酶的抑制使線粒體的呼吸耗氧完全受到抑制，而交替氧化酶抑制劑SHAM對呼吸功能沒有影響。盡管抗體檢測發(fā)現了線粒體解偶聯蛋白(UCP)的存在，但它對增強高山離子

4、芥的抗寒能力貢獻不大，低溫誘導并不會引起UCP蛋白的積累。因此，高山離子芥線粒體具有特殊的能量耗散體系。 3．質膜14-3-3蛋白在受到低溫誘導時積累增加，表明高山離子芥跨質膜轉運調節(jié)能力增強，但是，隨著低溫強度的升高此調節(jié)作用受到限制。低溫誘導引起了線粒體NAD(P)H氧化功能的顯著升高，這種增強的NAD(P)H氧化途徑對魚藤酮的敏感性很低，表現為交替型NAD(P)H脫氫酶(AtNDH)特征，這條交替途徑介導了重要的抗寒途徑。

5、 4．利用Native-PAGE和Gel-filtration，從高山離子芥線粒體中分離得到一個具有催化NADH: quinone氧化還原功能的脫氫酶復合體。該復合體由5個亞基組成，催化NADH脫氫不受魚藤酮抑制，選擇性的以泛醌類似物CoQ<,0>為電子受體，其中58kD亞基為催化亞基，以黃素腺苷二磷酸(FAD)作為輔酶，western-blotting研究發(fā)現該催化亞基為硫辛酸脫氫酶2(LPD<,2>)；26kD亞基為一個小分

6、子伴侶蛋白sHsp，和LPD<,2>發(fā)生直接的相互作用。因此，LPD<,2>在高山離子芥線粒體中以復合體形式存在，行使類似AtNDH催化功能，小分子伴侶蛋白sHsp可以穩(wěn)定復合體組裝，保證酶活性即使在低溫脅迫條件下也免受損傷。 5．利用Native-PAGE從擬南芥線粒體中分離得到了一個類似于高山離子芥LPD脫氫酶的復合體，此復合體由5個亞基組成，催化NAD(P)H：quinone氧化還原反應，高選擇性的以CoQ<,0>作為電子

7、受體，并且以NADPH作為底物時的反應速率高于對NADH的催化速率。MOLDI-ToF鑒定發(fā)現LPD<,2>和N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸還原酶(NAGPR)分別催化NADH和NADPH的脫氫，另外3個亞基分別為：蘋果酸脫氫酶(MDH)，天冬氨酸轉氨酶(AAT)和分子伴侶Cpn20。 6．利用免疫共沉淀技術進一步驗證擬南芥NAD(P)H：quinone復合體各亞基之間的相互作用，對其組裝及作用機理進行研究。NAGPR抗體免疫沉淀研究

8、發(fā)現， LPD，MDH和Cpn20可以得到共純化，表明這些蛋白質確實可以通過相互之間作用形成復合體。細胞免疫熒光共定位則進一步證實了這些亞基在體內也存在類似的相互作用。因此通過蛋白質相互作用可以得到該復合體的作用機制：線粒體NADH:quinone氧化還原和蘋果酸/天冬氨酸穿梭相偶聯，其中LPD<,2>和NAGPR催化NAD(P)H:quinone氧化還原，MDH和NAGPR介導NADH通過蘋果酸/天冬氨酸穿梭進入線粒體基質，直接被LP

9、D<,2>利用，這種偶聯機制可能依賴于分子伴侶Cpn20。該復合體的生理功能在于催化一個雙電子傳遞過程，避免泛醌類自由基在線粒體中積累，對植物抵御環(huán)境脅迫，避免氧化性損傷具有重要意義。 以上研究結果表明，高山離子芥可以在細胞水平上對冷凍脅迫作出適應性調節(jié)。在早期冷誘導下，細胞泛醌活躍的氧化還原性調節(jié)既可以保證電子傳遞鏈的流暢又可以穩(wěn)定細胞活性氧水平，避免細胞遭受氧化性損傷。高山離子芥線粒體能量耗散系統不同于其他植物，其特殊性表現