從線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑探討健脾益腎沖劑防治胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制.pdf

1、胃癌是嚴(yán)重威脅人民生命健康的惡性腫瘤之一，在我國(guó)胃癌的發(fā)生率在各類惡性腫瘤中居第2位，病死率居各類惡性腫瘤中第1位，在老年人群中病死率有增加的趨勢(shì)。因此，尋找有效治療胃癌的藥物和方法是目前抗腫瘤研究的一個(gè)重要課題。中醫(yī)藥療法是胃癌綜合治療中的重要手段之一，中藥對(duì)于降低術(shù)后復(fù)發(fā)率、減輕放化療不良反應(yīng)、延長(zhǎng)患者生存期、改善患者的生存質(zhì)量有著重要的意義。健脾益腎沖劑是導(dǎo)師在長(zhǎng)期防治胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的臨床經(jīng)驗(yàn)和多年的實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上研制而成的，

2、在實(shí)際應(yīng)用中顯示了良好的療效。本課題正是在導(dǎo)師前期工作的基礎(chǔ)上，以國(guó)家自然科學(xué)基金課題(NO.30600839)為依托開展的，研究工作從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)延伸至臨床，采用流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)、TUNEL、AV/PI、Realtime RT—PCR、免疫組化(IHC)等技術(shù)，從整體——細(xì)胞——分子水平，深入探討了健脾益腎沖劑防治胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。取得的主要研究結(jié)論和成果如下：
　　 1.健脾益腎沖劑是導(dǎo)師在長(zhǎng)期防治胃癌

3、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的臨床經(jīng)驗(yàn)和多年的實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上研制而成的，經(jīng)過多年的臨床應(yīng)用顯示出良好的療效。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)其可以抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物復(fù)發(fā)瘤的生長(zhǎng)，推遲肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生，還可以減少腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。其中最高復(fù)發(fā)瘤抑制率為術(shù)后10天時(shí)(63.87％)，最高肺轉(zhuǎn)移抑制率為術(shù)后5天時(shí)(40％)。
　　 2.采用TUNEL法和AV/PI雙染色兩種方法，測(cè)定615小鼠復(fù)發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶腫瘤組織細(xì)胞凋亡率，證實(shí)健脾益腎沖劑具有誘導(dǎo)615小鼠前胃癌肺

4、轉(zhuǎn)移灶和復(fù)發(fā)灶中腫瘤細(xì)胞凋亡的作用(轉(zhuǎn)移灶和復(fù)發(fā)灶細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI％)分別為4.88±2.56％和9.53±0.26％，明顯高于模型組，P<0.05)，從而減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，達(dá)到一定的治療效果。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可能是其防治復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要作用機(jī)制之一。
　　 3.應(yīng)用免疫組化方法探討線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白Caspase3、Caspase9、Cytc、Smac、Omi/HtrA2和XIAP的表達(dá)在其腫瘤細(xì)胞凋亡中的變

5、化規(guī)律，證實(shí)健脾益腎沖劑可以促進(jìn)術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移小鼠模型肺轉(zhuǎn)移灶中促凋亡相關(guān)蛋白caspase9、caspase3、CytC、Smac和Omi/HtrA2的表達(dá)(與模型組相比P<0.05)，而對(duì)于凋亡抑制蛋白XIAP則影響不大(與模型組相比P>0.05)。說明健脾益腎沖劑可能通過上調(diào)線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑中caspase9、caspase3和CytC、Smac、Omi/HtrA2的表達(dá)，起到促腫瘤細(xì)胞凋亡作用，這可能是健脾益腎沖劑抑制腫瘤復(fù)發(fā)

6、和轉(zhuǎn)移的重要作用機(jī)制之一。這一結(jié)論也為中藥復(fù)方防治腫瘤的研究提供了更多科學(xué)依據(jù)。
　　 4.采用RT—PCR技術(shù)，測(cè)定615小鼠復(fù)發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶腫瘤組織中caspase9、3和Cytc、Smac、Omi/HtrA2、XIAP等凋亡相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)，進(jìn)一步證明了健脾益腎沖劑具有促進(jìn)術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移小鼠模型肺轉(zhuǎn)移灶中促凋亡相關(guān)蛋白caspase9、caspase3、CytC、Smac和Omi/HtrA2表達(dá)的作用(與模型組相比P<0

7、.05)，與免疫組化方法得到的結(jié)果相一致。同時(shí)健脾益腎沖劑對(duì)凋亡途徑中多個(gè)蛋白的作用及其機(jī)制的研究，也為驗(yàn)證中藥復(fù)方的多靶點(diǎn)效應(yīng)增添了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 5.采用poly—HEMA包被的六孔板建立了人胃低分化粘液腺癌MGC803細(xì)胞系和人胃低分化腺癌BGC823細(xì)胞系的失巢模型，通過改良的轉(zhuǎn)瓶瓊脂培養(yǎng)法建立了人胃低分化粘液腺癌MGC803細(xì)胞系和人胃低分化腺癌BGC823細(xì)胞系的腫瘤多細(xì)胞球體(MTS)模型。兩種模型分別較好地模擬

8、了腫瘤細(xì)胞的失巢狀態(tài)和體內(nèi)生長(zhǎng)狀態(tài)。
　　 6.采用MTT法證實(shí)了大鼠含藥(健脾益腎沖劑)血清對(duì)人胃癌MGC—803細(xì)胞系及BGC—823細(xì)胞系的生長(zhǎng)均具有抑制作用，而且與空白大鼠血清抑制率相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，排除了大鼠血清成分對(duì)藥效的干擾。并通過對(duì)不同濃度的血清抑制率的觀測(cè)，確定了后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將要采取的含藥血清濃度和化療藥物濃度。含藥血清干預(yù)濃度為15％血清濃度，DDP的干預(yù)濃度為1μg/ml。(實(shí)驗(yàn)中采用的大鼠血清藥理學(xué)方法

9、參照《中藥含藥血清體外實(shí)驗(yàn)操作參考規(guī)程(草案)》)。
　　 7.通過AV/PI雙染色法檢測(cè)了大鼠含藥(健脾益腎沖劑)血清對(duì)人胃癌細(xì)胞系MGC803和BGC823失巢及多細(xì)胞球體模型的促凋亡作用，證實(shí)大鼠含藥(健脾益腎沖劑)血清對(duì)人胃癌MGC—803細(xì)胞系及BGC—823細(xì)胞系失巢模型及多細(xì)胞球體(MTS)模型生長(zhǎng)均具有誘導(dǎo)凋亡作用(與空白大鼠血清組相比P<0.05)，凋亡率與作用時(shí)間成正比，且中藥的促凋亡作用對(duì)胃癌的這兩種細(xì)胞株

10、之間不具有差異(兩者相比者P>0.05)。
　　 8.使用FCM檢測(cè)大鼠含藥(健脾益腎沖劑)血清對(duì)人胃癌細(xì)胞系MGC803和BGC823多細(xì)胞球體(MTS)模型腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位的作用，證實(shí)健脾益腎沖劑含藥血清可明顯降低兩種模型腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位水平，其降低程度和作用時(shí)間呈正比。說明健脾益腎沖劑可以通過降低線粒體膜電位，誘導(dǎo)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。這可能是其防治惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要作用機(jī)制之一。<

11、br>　　 9.使用比色法檢測(cè)大鼠含藥(健脾益腎沖劑)血清對(duì)人胃癌細(xì)胞系MGC803和BGC823多細(xì)胞球體(MTS)模型caspase3、caspase9活性的影響，觀察到在兩種模型中均能活化和誘導(dǎo)caspase3、caspase9蛋白表達(dá)(其相對(duì)活性大鼠含藥血清組均高于空白血清組，P<0.05)。進(jìn)一步證明健脾益腎沖劑可以通過促進(jìn)caspase9和caspase3的活化和表達(dá)，使其參與凋亡的啟動(dòng)和執(zhí)行，從而啟動(dòng)caspase蛋白酶

12、級(jí)聯(lián)切割過程，進(jìn)而啟動(dòng)線粒體介導(dǎo)的凋亡過程，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本研究為中藥防治腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供了科學(xué)依據(jù)。
　　 10.健脾益腎沖劑可以顯著提高胃癌術(shù)后患者血清抑制人胃癌細(xì)胞系MGC803和BGC823增殖的能力。服用健脾益腎沖劑后患者血清抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力明顯高于服用前(對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率由10％左右提高至40％—50％)，與正常對(duì)照組相比較也有意義(P<0.05)。這可能是其抑制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制之一。研究患

13、者病理狀態(tài)下中藥復(fù)方含藥血清的作用，是血清藥理學(xué)方法學(xué)上的有益嘗試，其結(jié)果是否更加真實(shí)反映患者血清移行成分的作用，仍有待于進(jìn)一步深入研究。
　　 本研究的創(chuàng)新之處：
　　 1.理論創(chuàng)新：本研究提出“保護(hù)失巢凋亡是防治胃癌轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制”這一工作假說，以荷瘤小鼠術(shù)后轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型和人胃癌細(xì)胞系MGC803和BGC823失巢模型及多細(xì)胞球體培養(yǎng)模型為載體，通過線粒體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，探討健脾益腎沖劑保護(hù)胃癌轉(zhuǎn)移過程中失巢凋亡

14、的分子機(jī)制，驗(yàn)證了該假說的客觀性。從一個(gè)側(cè)面揭示了中醫(yī)扶正祛邪抗腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移理論的內(nèi)涵，具有重要的理論和實(shí)踐意義。
　　 2.方法創(chuàng)新：本研究引入人胃癌細(xì)胞系MGC803和BGC823多細(xì)胞球體(MTS)培養(yǎng)模型，進(jìn)行失巢凋亡及中藥復(fù)方研究，經(jīng)檢索查新，國(guó)內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。
　　 3.指標(biāo)創(chuàng)新：將線粒體凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)調(diào)控因子Smac、Omi/HtrA2和XIAP與胃癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移緊密聯(lián)系，進(jìn)行深入研究探討，目前