幽門螺桿菌通過線粒體—細胞色素C凋亡途徑對胃癌發(fā)生的影響.pdf

1、第一部分 H.Pylori對胃癌及癌旁組織Bcl-2家族蛋白表達的影響材料與方法1.標本來源:收集2001年2月~2002年12月于該院行胃腺癌切除術的重慶地區(qū)患者(近4周未服抗H. Pylori藥物)手術標本共95例,其中男72例,女23例,年齡31~84歲,平均56.6歲,胃癌組織均經病理學確診,癌旁組織為手術切緣組織,經HE染色確定是不存在癌及癌前病變的組織.胃癌及癌旁組織立即置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?采用Warthin-Star

2、ry銀染色法和H. Pylori尿素酶基因PCR法診斷H.Pylori感染,H. Pylori cagA基因PCR法進行cagA<'+>H.Pylori鑒定.Warthin-Starry銀染色法和尿素酶基因PCR法均為陽性者診斷為H.Pylori感染陽性患者,共58例(其中cagA<'+>H.Pylori感染者占37例),H.Pylori感染陰性患者37例.2.實驗指標及方法2.1 半定量RT-PCR法檢測Bcl-2、Bid及Bax m

3、RNA表達2.2 Western Blotting法檢測Bcl-2、Bid及Bax蛋白表達3. 統計學處理:采用X<'2>檢驗和Spearman等級相關分析.結果1. H. Pylori對胃癌及癌旁組織Bcl-2、Bid及Bax mRNA表達的影響1.1 胃癌組織中,Bid和Bax mRNA表達按H.Pylori陰性組、cagA<'->H.Pylori感染組和cagA<'+>H.Pylori感染組順序依次增高(Bid:0.30、0.42

4、和0.85;Bax:0.30、0.65和0.97),且差異有顯著性(P<0.05);H.Pylori陰性組的Bcl-2 mRNA表達低于cagA<'-> H.Pylori感染組和cagA<'+>H. Pylori感染組(0.41 vs. 0.69和0.84,P<0.05),但cagA<'->H.Pylori感染組和cagA<'+>H.Pylori感染組間的Bcl-2表達無顯著性差異.1.2 癌旁組織中,Bid、Bax和Bcl-2 mRN

5、A表達按H.Pylori陰性組、cagA<'->H.Pylori感染組和cagA<'+>H.Pylori感染組順序均依次遞增(Bid:0.37、0.68和0.93;Bax:0.35、0.64和1.00;Bcl-2:0.37、0.48和0.61),且差異有顯著性(P<0.05).2.H.Pylori對胃癌及癌旁組織Bcl-2、Bid及Bax蛋白表達的影響2.1 胃癌組織中,Bid、Bax和Bcl-2蛋白表達按H.Pylori陰性組、cag

6、A<'->H.Pylori感染組和cagA<'+> H.Pylori感染組順序依次增高.2.2 癌旁組織中,Bid、Bax和Bcl-2蛋白表達按H.Pylori陰性組、cagA<'->H.Pylori感染組和cagA<'+>H.Pylori感染組順序均依次遞增.3. Bid、Bax和Bcl-2 mRNA在胃癌及癌旁組織中表達的相互關系3.1H.Pylori陰性組中,胃癌組織的Bid和Bax表達與Bcl-2表達呈負相關(Bid vs. B

7、cl-2,r = -0.40,P<0.05;Bax vs. Bcl-2,r = -0.45,P<0.05).3.2 H. Pylori陽性組中,胃癌組織的Bid和Bax表達與Bcl-2表達無相關性(Bid vs. Bcl-2, r = 0.18, P>0.05; Bax vs. Bcl-2, r = 0.20, P>0.05);癌旁組織的Bid和Bax表達與Bcl-2表達呈正相關(Bid vs. Bcl-2,r = 0.33,P<0.0

8、5;Bax vs. Bcl-2,r = 0.29,P<0.05).討論細胞凋亡的信號轉導存在兩種途徑-死亡受體途徑和線粒體-Cyt-c途徑,其中Bcl-2家族與線粒體-Cyt-c途徑的關系十分密切.Bid、Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中具有代表性的三個成員,Bid和Bax蛋白能夠促進線粒體釋放Cyt-c,從而促進細胞凋亡;而Bcl-2則抑制線粒體釋放Cyt-c,具有抑制細胞凋亡的作用.在Bcl-2家族調控細胞凋亡的機制中,Bid作

9、為BH3結構域蛋白,是誘發(fā)細胞凋亡的起始因素之一,而Bax是這一機制中的關鍵成員,無論是Bid等BH3結構域蛋白誘發(fā)細胞凋亡,還是Bcl-2抑制細胞凋亡,均需要依賴激活或抑制Bax來發(fā)揮作用.該研究發(fā)現,在胃癌和癌旁組織中,H. Pylori均能夠上調Bid和Bax表達,且cagA<'+>H.Pylori的作用更強;同時,在胃癌和癌旁組織中,H.Pylori還能夠上調Bcl-2表達.既然H.Pylori對Bid、Bax和Bcl-2的表達

10、都有上調作用,那么這三者之間的關系是怎樣的呢?進一步的分析表明,在H.Pylori陰性組,胃癌組織的Bid和Bax表達與Bcl-2表達呈負相關,這符合胃癌組織細胞凋亡減少的規(guī)律;而在H.Pylori陽性組中,胃癌組織的Bid、Bax和Bcl-2的表達均增高,Bid、Bax表達和Bcl-2表達無相關性,癌旁組織的Bid和Bax表達與Bcl-2表達呈正相關,這些結果提示,雖然H. Pylori對Bid、Bax和Bcl-2均有上調表達的作用,

11、但在胃黏膜癌變的不同時期所起的作用可能并不完全相同,在慢性胃炎時,H.Pylori可能主要上調Bid和Bax這些促凋亡基因的表達,此作用強于其對Bcl-2的上調作用,因而胃黏膜表現出凋亡增多的現象,而在胃黏膜癌變的過程中,H.Pylori上調Bcl-2等抑凋亡基因表達的作用可能會逐漸增強,Bcl-2的增多會抵消Bid和Bax的促細胞凋亡作用,細胞凋亡受到抑制,從而造成或加重了胃黏膜癌變過程中凋亡調控基因表達的紊亂.第二部分 H.Pylo

12、ri對胃癌及癌旁組織IL-1a表達的影響材料與方法1. 標本來源:同第一部分.2. 實驗指標及方法半定量RT-PCR法檢測IL-1a3. 統計學處理:采用X 2檢驗和Spearman等級相關分析.結果1. 胃癌組織中,IL-1a mRNA表達按H.Pylori陰性組、cagA<'->H.Pylori感染組和cagA<'+>H.Pylori感染組順序依次增高(0.79、1.18和2.10),且差異有顯著性(P<0.05).2. 癌旁組織中

13、,cagA<'+>H.Pylori感染組的IL-1a mRNA表達高于H.Pylori陰性組和cagA<'->H.Pylori感染組(1.03 vs. 0.62和0.75),且差異有顯著性(P<0.05).3. H.Pylori陽性組中,胃癌IL-1a mRNA表達與Bid、Bax mRNA表達呈正相關(IL-1a vs. Bid,r = 0.50,P<0.05;IL-1a vs. Bax,r = 0.46,P<0.05);癌旁組織IL

14、-1a mRNA表達與Bax mRNA表達呈正相關(r = 0.36,P<0.05).討論許多體內和體外的研究表明,H. Pylori致胃黏膜上皮細胞凋亡的機制中,除了細菌本身和細菌代謝產物的因素外,機體的免疫應答也起到十分重要的作用.H.Pylori可誘導固有層中的單核巨噬細胞、中性粒細胞活化,產生大量的細胞因子,且cagA<'+>H.Pylori的作用更強.該研究發(fā)現在胃癌和癌旁組織中,H.Pylori感染均能夠上調IL-1a mR

15、NA表達,這與多數文獻報道相符,而且cagA<'+>H.Pylori感染者的IL-1a表達強于cagA<'->H.Pylori感染者,這可能是因為cagA<'+>H.Pylori患者胃黏膜的中性粒細胞和單核細胞浸潤高于cagA<'->H.Pylori患者所致.研究IL-1a mRNA表達與Bid和Bax mRNA表達的相關性時,我們發(fā)現H.Pylori陽性組中,胃癌IL-1a表達與Bid、Bax表達呈正相關,癌旁組織IL-1a mRNA

16、表達與Bax mRNA表達呈正相關.盡管還不能確定IL-1a具有上調Bid和Bax表達的能力,但是由于IL-1a能夠上調胃上皮細胞的Fas表達,因此IL-1a也許能夠與H.Pylori協同作用,通過上調Fas表達來增強Bid和Bax表達,從而加重凋亡調控基因的表達紊亂.第三部分 H.Pylori對胃癌及癌旁組織Cyt-c及Caspase蛋白表達的影響材料與方法1. 標本來源:同第一部分.2. 實驗指標及方法2.1 半定量RT-PCR法檢

17、測Cyt-c、Caspase-9及Caspase-3表達2.2 Western Blotting法檢測Cyt-c、Caspase-9及Caspase-3蛋白表達3. 統計學處理:采用X<'2>檢驗.結果1. H.Pylori對胃癌及癌旁組織Cyt-c、Caspase-9及Caspase-3 mRNA表達的影響1.1 胃癌組織中,Cyt-c、Caspase-9及Caspase-3 mRNA表達在H.Pylori陰性組、cagA<'->H.

18、Pylori感染組和cagA<'+>H.Pylori感染組中沒有顯著性差異(Cyt-c:0.64、0.61和0.62;Caspase-9:0.84、0.89和0.97;Caspase-3:0.77、0.68和0.71)(P>0.05).1.2 癌旁組織中,Cyt-c、Caspase-9及Caspase-3 mRNA表達在H.Pylori陰性組、cagA<'->H.Pylori感染組和cagA<'+>H.Pylori感染組中沒有顯著性差異

19、(Cyt-c:0.57、0.54和0.64;Caspase-9:0.91、0.89和0.99;Caspase-3:0.81、0.87和0.81)(P>0.05).2.H.Pylori對胃癌及癌旁組織Cyt-c、Caspase-9及Caspase-3蛋白表達的影響2.1 胃癌組織及癌旁組織中,Cyt-c蛋白表達在H. Pylori陰性組、cagA<'-> H. Pylori感染組和cagA<'+> H.Pylori感染組中沒有差異.2.2

20、 胃癌組織及癌旁組織中,激活的Caspase-9及Caspase-3蛋白在H. Pylori陰性組、cagA<'->H.Pylori感染組和cagA<'+>H.Pylori感染組中依次增高.討論與細胞凋亡的信號轉導途徑相對應,Caspase的激活也存在細胞內和細胞外兩種途徑,其中細胞外途徑是指細胞外配體與相應的細胞膜受體結合后,通過接頭蛋白(adapter protein)導致Caspase-8在局部募集并發(fā)生自激活,激活后的Caspa

21、se-8可以依次激活其他的Caspase酶,包括啟動型Caspase(如Caspase-9)和效應型Caspase(Caspase-3、6、7).細胞內途徑是指當應激、射線、細胞外基質缺乏等因素引發(fā)細胞凋亡時,線粒體PT孔(PTP)開放,線粒體釋放Cyt-c到胞漿中,當dATP同時存在時,胞漿中的Apaf-1與Caspase-9結合,并使Caspase-9發(fā)生自激活,激活后的Caspase-9能夠激活下游效應型Caspase(Caspa

22、se-3、6、7),引起細胞凋亡.該研究發(fā)現,盡管在胃癌和癌旁組織中,Cyt-c、Caspase-9及Caspase-3 mRNA表達在H. Pylori陰性組、cagA- H. Pylori感染組和cagA+ H. Pylori感染組中沒有顯著性差異,但蛋白檢測卻發(fā)現激活的Caspase-9及Caspase-3蛋白在H. Pylori陰性組、cagA<'->H. ylori感染組和cagA<'+>H.Pylori感染組中依次增高,說明

23、雖然H.Pylori不影響Caspase-9及Caspase-3表達,但確實可以促進Caspase-9及Caspase-3激活,這也許是胃黏膜組織中Bid和Bax表達上調的結果,因為Bid和Bax表達上調可以促進線粒體釋放Cyt-c,從而依次激活Caspase-9和Caspase-3.H.Pylori感染對Cyt-c的mRNA表達和蛋白水平無影響,可能是由于發(fā)生凋亡時,Cyt-c僅僅發(fā)生了從線粒體到胞漿的移位,而并不表現出mRNA和蛋白

24、水平的變化.由此可見,H. Pylori能夠促進Caspase-9及Caspase-3激活,也就是說能夠通過線粒體-Cyt-c途徑途徑引發(fā)細胞凋亡,但H.Pylori是否能夠直接通過線粒體-Cyt-c途徑引發(fā)細胞凋亡,還是必須依靠死亡受體途徑、間接激活線粒體-Cyt-c途徑引發(fā)細胞凋亡?我們進一步研究了H.Pylori對胃癌細胞株SGC-7901和AGS細胞凋亡的影響.第四部分 H.Pylori對SGC-7901和AGS細胞凋亡的影響材

25、料與方法1. H.Pylori國際標準菌株NCTC 11637的固體培養(yǎng).2. 胃癌細胞株SGC-7901和AGS細胞的培養(yǎng).3. NCTC 11637誘導SGC-7901和AGS細胞凋亡的時效和量效觀察.3.1 細胞處理:調整細胞濃度為1×10<'6>/ml,接種于培養(yǎng)瓶中(1ml/瓶),加4ml培養(yǎng)液.3.2 時效和量效觀察:①對照組:未加入NCTC 11637;②處理組:調整NCTC 11637與細胞數量之比為100:1、50:1

26、和25:1,分別與細胞共同培養(yǎng),取不同時相(0h、6h、12h、24h和48h)細胞用于流式細胞檢測.4. NCTC 11637對SGC-7901和AGS細胞Bcl-2家族蛋白、Cyt-c及Caspase蛋白表達的影響.4.1 取不同時相(0h、6h、12h、24h和48h)細胞提取總RNA和總蛋白4.2 半定量RT-PCR法檢測Bcl-2、Bid、Bax、Cyt-c、Caspase-9及Caspase-3 mRNA表達4.3 West

27、ern Blotting法檢測Bcl-2、Bid、Bax、Cyt-c、Caspase-9及Caspase-3蛋白表達5. Caspase抑制劑對NCTC 11637所誘導SGC-7901和AGS細胞凋亡的影響5.1 細胞處理:調整細胞濃度為1×10<'6>/ml,接種于培養(yǎng)瓶中(1ml/瓶),加4ml培養(yǎng)液.5.2 調整NCTC 11637與細胞數量之比為50:1,與細胞共同培養(yǎng),同時分別加入Caspase-8、Caspase-9和Ca

28、spase-3抑制劑,取不同時相(0h、6h、12h、24h和48h)細胞用于流式細胞檢測.結果1. NCTC 11637對SGC-7901和AGS細胞凋亡的影響1.1 NCTC 11637對SGC-7901細胞凋亡的影響NCTC 11637呈劑量依賴性地直接誘導SGC-7901細胞凋亡,隨著其濃度的加大,細胞的凋亡率也越來越高;NCTC 11637呈時間依賴性地誘導SGC-7901細胞凋亡.1.2 NCTC 11637對AGS細胞凋亡

29、的影響NCTC 11637呈劑量依賴性地直接誘導AGS細胞凋亡,隨著其濃度的加大,細胞的凋亡率也越來越高;NCTC 11637呈時間依賴性地誘導AGS細胞凋亡.2. NCTC 11637對SGC-7901細胞Bcl-2家族蛋白、Cyt-c及Caspase蛋白表達的影響2.1 NCTC 11637上調SGC-7901細胞Bid、Bax、Cyt-c、Caspase-9及Caspase-3 mRNA表達,但對Bcl-2 mRNA表達無影響.2

30、.2 NCTC 11637上調SGC-7901細胞Bid、Bax、Cyt-c、Caspase-9及Caspase-3蛋白表達,但對Bcl-2蛋白表達無影響.3. NCTC 11637對AGS細胞Bcl-2家族蛋白、Cyt-c及Caspase蛋白表達的影響3.1 NCTC 11637上調AGS細胞Bid、Bax、Cyt-c、Caspase-9及Caspase-3 mRNA表達,但對Bcl-2 mRNA表達無影響.3.2 NCTC 1163

31、7上調AGS細胞Bid、Bax、Cyt-c、Caspase-9及Caspase-3蛋白表達,但對Bcl-2蛋白表達無影響.4. Caspase抑制劑對NCTC 11637所誘導SGC-7901和AGS細胞凋亡的影響4.1 NCTC 11637對SGC-7901細胞凋亡的影響Caspase-9和3能夠幾乎完全抑制NCTC 11637所致的SGC-7901細胞凋亡,Caspase-8能夠部分抑制NCTC 11637所致的SGC-7901細胞

32、凋亡.4.2 Caspase抑制劑對AGS細胞凋亡的影響Caspase-9和3能夠幾乎完全抑制NCTC 11637所致的AGS細胞凋亡,Caspase-8能夠部分抑制NCTC 11637所致的AGS細胞凋亡.討論有研究表明,H.Pylori既可以通過細菌自身或其產物直接誘導胃黏膜上皮細胞凋亡,也可以通過H.Pylori感染時所致的宿主反應間接誘導細胞凋亡.該研究觀察了H.Pylori國際標準株NCTC11637對體外培養(yǎng)的人胃腺癌細胞株

33、SGC-7901和AGS細胞凋亡的影響,結果發(fā)現,H.Pylori能夠直接誘導胃上皮細胞凋亡,且呈劑量依賴性,隨著H.Pylori濃度的加大,細胞的凋亡率也越來越高;NCTC 11637能夠呈時間依賴性地誘導細胞凋亡.AGS細胞的凋亡率高于SGC-7901細胞的凋亡率,這可能是因為二者的p53蛋白狀態(tài)不同,AGS細胞是野生型p53蛋白,而SGC-7901細胞是突變型p53蛋白,這與文獻報道的H.Pylori誘導野生型p53細胞的凋亡率較

34、高是一致的.NCTC 11637還能夠呈時間依賴性地上調SGC-7901和AGS細胞的Bid和Bax mRNA表達和蛋白水平,但是與體內研究結果不同的是,SGC-7901和AGS細胞與H.Pylori共同孵育后,Bcl-2 mRNA表達及蛋白水平的變化均不明顯,沒有顯著的增高或降低,提示在H.Pylori急性感染誘導胃上皮細胞凋亡的機制中,Bcl-2本身可能并不是主要的調節(jié)因素,H.Pylori可能主要上調促凋亡基因如Bid和Bax等的

35、表達,而對抗凋亡基因如Bcl-2等的表達無明顯影響.除此之外,H.Pylori還能夠呈時間依賴性地上調胃上皮細胞的Cyt-c、Caspase-9及Caspase-3表達,Caspase-9和3抑制劑能夠幾乎抑制所有H.Pylori所致的凋亡,而Caspase-8抑制劑僅能部分抑制凋亡,這提示H.Pylori也許主要通過Caspase-9-即線粒體-Cyt-c途徑來誘導胃上皮細胞凋亡.因此我們認為,H.Pylori能夠直接誘導胃上皮細胞凋

36、亡,其中的機制可能是H.Pylori上調了Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bid、Bax等的表達,并且主要是通過線粒體-Cyt-c途徑來誘導細胞凋亡.結論通過上述研究我們得出如下結論:1.H.Pylori感染具有促進胃黏膜Bid、Bax和Bcl-2表達的作用,并且能夠造成這些凋亡調控基因的表達紊亂.2.H.Pylori感染能夠上調胃黏膜的IL-1a表達,IL-1a與H.Pylori協同作用,也許會加重Bcl-2家族基因的表達紊亂.3.H.Py