高山離子芥冷調(diào)節(jié)基因CbCOR15提高轉(zhuǎn)基因煙草抗寒性的研究.pdf

1、高山離子芥Chorispora bungeana是一種典型的高山冰緣植物，具有很強的抗凍性，是研究植物適應(yīng)冷凍環(huán)境分子機制的理想材料。我們從高山離子芥中克隆得到一種新的冷調(diào)節(jié)基因，命名為CbCOR15。使用半定量PCR技術(shù)對CbCOR15在不同組織中和不同脅迫下的表達模式進行了研究。CbCOR15切除推測的葉綠體跨膜導(dǎo)肽序列得到CbCOR15m，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將CbCOR15，CbCOR15m轉(zhuǎn)入煙草中，分析轉(zhuǎn)基因煙草的抗逆性。

2、結(jié)果如下：
　　 1.使用RACE技術(shù)擴增得到完整的高山離子芥冷調(diào)節(jié)基因CbCOR15，將cDNA序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(序列接受號為EF208112)。CbCOR15基因全長612bp，包含一個423 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼140個氨基酸的蛋白，起始密碼子前面有83 bp的5'非翻譯區(qū)，編碼區(qū)后面有106 bp包含poly(A)的3'非翻譯區(qū)。軟件計算高山離子芥CbCor15蛋白的等電點為5.20，推測其分子量為1

3、4.9kDa。CbCor15蛋白與已知的ApCOR15a、AtCOR15a、AtCOR15b、 BN115、CBCOR15等蛋白高度同源。說明CbCOR15屬于COR15基因家族。在植株受到環(huán)境低溫脅迫時，該基因家族的基因通常在與植物生長相關(guān)的組織中表達。
　　 2.序列分析顯示，CbCor15蛋白富含親水性氨基酸，具有很高的親水性，特別是C-terminal2/3的區(qū)域中幾乎都是親水域。α螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)交錯構(gòu)成了二級結(jié)構(gòu)

4、的主要部分。軟件分析推測在CbCor15蛋白的N-terminal存在葉綠體跨膜導(dǎo)肽。說明CbCor15蛋白很可能是切除導(dǎo)肽序列進入葉綠體后形成成熟的蛋白CbCor15m，保護細(xì)胞膜與葉綠體膜系統(tǒng)的完整性，提高植株的抗逆能力。
　　 3.研究CbCOR15基因在不同組織和不同脅迫處理中的表達情況，發(fā)現(xiàn)2℃冷脅迫1 d的植株，只能在葉片中檢測到CbCOR15基因的表達，在根中檢測不到表達。說明CbCOR15是一個組織特異性表達的基

5、因，與其定位于葉綠體的推測相吻合；CbCOR15基因在冷凍低溫(4℃，0℃，-4℃)處理下誘導(dǎo)表達，到第7天仍保持在較高水平。而且處理溫度越低，表達越迅速，-4℃時的表達量最快達到頂峰。說明CbCOR15是一種冷誘導(dǎo)的功能基因，長期保護植株免受低溫傷害，對植株抵御冷凍低溫起重要作用。另外，CbCOR15基因還可以被ABA，PEG誘導(dǎo)表達，但不能被H2O2誘導(dǎo)表達。說明CbCOR15參與多種脅迫的調(diào)節(jié)途徑(如冷凍脅迫，脫水脅迫)，但不參與

6、清除活性氧的調(diào)節(jié)途徑。
　　 4.通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將CbCOR15和CbCOR15m導(dǎo)入煙草葉片中。使用分子生物學(xué)方法分析不同轉(zhuǎn)基因植株中外源基因在RNA水平和蛋白水平的表達量。結(jié)果顯示不同植株中外源插入基因的RNA水平和蛋白水平的表達量存在很大差異，但RNA水平和蛋白水平的表達量是相對應(yīng)的。研究高量表達外源基因的植株和低量表達外源基因的植株抵抗低溫的能力，發(fā)現(xiàn)低溫處理下它們的相對電導(dǎo)率，MDA含量，葉綠素含量和相對含水量

7、等抗逆性的理指標(biāo)沒有顯著差異。說明植株抵抗低溫的能力與CbCOR15的積累不直接相關(guān)。推測單個COR基因表達量的積累只能有限的影響植株的抗逆性，植物抗寒性的提高是一個復(fù)雜的過程，由一系列的基因聯(lián)合參與作用。
　　 5.研究轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性，發(fā)現(xiàn)CbCOR15轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較對照植株和CbCOR15m轉(zhuǎn)基因植株更少的相對電導(dǎo)率和MDA含量，更多的葉綠素含量和相對含水量。結(jié)果顯示在冷脅迫下CbCOR15轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性明顯高于

8、對照植株，而CbCOR15m轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性較之對照植株沒有提高。說明切除了葉綠體導(dǎo)肽的CbCOR15m不能和CbCOR15一樣，通過保護質(zhì)膜穩(wěn)定性，防止水分流失和細(xì)胞結(jié)晶化，增強植物的抗寒性。在抗凍性的實驗中，對照植株的EL50僅為-2.1℃，而CbCOR15轉(zhuǎn)基因植株的EL50可達到-4℃。說明CbCOR15能夠提高轉(zhuǎn)基因植株的抗凍性。我們認(rèn)為CbCOR15基因在轉(zhuǎn)基因煙草獲得抗寒/凍性中發(fā)揮重要作用。
　　 綜上所訴，高