CBF-,3-和COR15a基因對煙草抗寒性的影響.pdf

1、煙草(NicotianatabacumL.)，茄科(Soalnaceae)、煙屬(Nicotiana)，主要起源于美洲、大洋洲及南太平洋的一些島嶼，大約在明朝萬歷年間(1573～1619年)傳入我國，目前發(fā)現(xiàn)的煙屬植物有66種。煙草是喜溫作物，1～2℃低溫時植株即死亡，10～13℃生長停止。在成熟期晝夜平均在16～17℃以下，葉片品質低劣。因此，低溫寒害是影響煙草生產(chǎn)的重要限制因子，嚴重的影響其產(chǎn)量和品質。 本實驗將低溫誘導啟動

2、子RD29a控制的GUS基因轉入煙草，以探明擬南芥RD29a啟動子在煙草植株中的表達特性；同時，將該啟動子分別控制的擬南芥CBF3低溫應答轉錄激活因子基因和COR15a冷誘導基因一起轉入煙草，以期利用CBF3的快速和高效激活所有攜帶CRT/DRE元件的冷誘導基因表達，以及COR15a抗寒基因對光合膜等內膜系統(tǒng)的強力保護，達到提高煙草植株的整體抗寒性和低溫下的光合作用能力的目的。我們期望這種抗寒改良策略在模式植物煙草上的成功，以便為其他經(jīng)

3、濟作物的抗寒性改良提供理論和實踐依據(jù)。主要研究結果如下： 1.分別將RD29a-GUS基因和RD29a-CBF3與RD29a-COR15a雙價基因導入煙草材料K326中，PCR擴增檢測結果表明有陽性擴增條帶，初步證明外源基因已經(jīng)整合到煙草基因組中。 2.轉RD29a-GUS基因植株作GUS組織化學染色實驗，結果表明，RD29a啟動子在煙草中同在擬南芥中一樣，不具有組織表達特異性，而是低溫誘導型啟動子。它在25℃常溫下不表

4、達，10℃左右為誘導臨界溫度，4℃左右穩(wěn)定和高效表達。 3.轉RD29a-CBF3和RD29a-COR15a雙價基因植株的低溫抗寒性實驗結果顯示，轉基因植株在1℃48h未出現(xiàn)萎蔫，冰點溫度-2℃，而非轉基因植株1℃12h即出現(xiàn)萎蔫狀態(tài)，冰點溫度-1℃。電導率測定和用Logistic方程擬合，得到轉基因植株LT50為-1.01℃左右，非轉基因植株LT50為0.86℃。轉基因植株的細胞膜傷害率比非轉基因植株低20﹪，半致死溫度低約1

5、.87℃。轉基因植株的POD活性、可溶性糖含量和脯氨酸含量分別是非轉基因植株的3.42倍、2.57倍、1.23倍。 4.正常溫度下，轉RD29a-CBF3和RD29a-COR15a雙價基因植株生長狀況與非轉基因植株相似。但田間越冬栽植結果顯示，轉基因植株在抗寒性增強的同時，在植株形態(tài)上也發(fā)生了變化，主要特征有葉由長橢圓形變成柳葉狀、莖稈變細，易折斷、植株由高大直立變矮化、從生枝也增多、腋芽變得明顯等；當溫度回升后，植株的生長也基

6、本恢復正常，這說明以RD29a為啟動子的COR15a和CBF3基因的表達不會對轉基因植物造成不正常生長的影響。 5.通過對轉RD29a-CBF3和RD29a-COR15a雙價基因植株三個株系T1代種子進行Kan抗性萌發(fā)，結果為100∶27、100∶35和100∶23，均傾向于3∶1，表明該基因在T1代中的分離規(guī)律符合孟德爾遺傳規(guī)律，可能是單拷貝整合到煙草基因組中的。 6.轉RD29a-CBF3和RD29a-COR15a雙