STZ大鼠肝膽固醇代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)變化的研究.pdf

1、目的：外周組織轉(zhuǎn)出的膽固醇主要經(jīng)高密度脂蛋白(HDL)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟代謝。HDL前體是由肝細(xì)胞合成的，肝細(xì)胞中的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Al(ABCA1)表達(dá)增加時(shí)，HDL 前體也隨之增加。HDL前體入血后募集外周組織游離的膽固醇，并在血漿卵磷脂膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶(LCAT)作用下生成膽固醇酯，HDL成為成熟的HDL，成熟的HDL又被肝細(xì)胞膜上的HDL受體清道夫受體BI(SR-BI)識(shí)別結(jié)合后，將膽固醇轉(zhuǎn)入肝細(xì)胞，發(fā)揮其特定的生物功能或轉(zhuǎn)化成

2、膽汁酸，隨膽汁排出體外。膽固醇7a羥化酶(CYP7A1)是膽汁酸合成的限速酶，其活性的大小決定了膽汁酸合成的速度。研究報(bào)道，糖尿病時(shí)血總膽固醇升高，進(jìn)入肝臟的膽固醇也隨之增加，同時(shí)CYP7A1酶活性升高。那么，糖尿病肝臟膽固醇的攝入增多是否與肝臟ABCA1和SR-BI基因表達(dá)有關(guān)呢?糖尿病狀態(tài)肝CYP7A1酶活性升高是不是因CYP7A1表達(dá)增加而引起的呢?未見報(bào)道。 細(xì)胞內(nèi)脂肪酸代謝主要由過氧化物酶體增殖物激活受體a(PPARa

3、)調(diào)節(jié)，膽固醇代謝主要由肝X受體a(LXRa)調(diào)節(jié)。兩個(gè)核受體對(duì)脂肪酸和膽固醇代謝調(diào)節(jié)存在交互作。糖尿病狀態(tài)，脂肪動(dòng)員加強(qiáng)，增高的游離脂肪酸可激活肝PPARa。那么，糖尿病狀態(tài)PPARa被脂肪酸激活時(shí)，肝中LXRa是否也被激活?肝膽固醇相關(guān)基因的表達(dá)會(huì)不會(huì)隨著LXRa的激活而改變呢?未見報(bào)道。 非諾貝特是PPARa的人工合成配體，是臨床常用的降脂藥，它除了通過激活PPARa促進(jìn)與脂肪酸分解代謝有關(guān)的酶基因表達(dá)，加強(qiáng)脂肪酸的分解達(dá)

4、到降血脂的目的外，也有輕微的降血總膽固醇的作用。糖尿病時(shí)它是否通過激活PPARa進(jìn)而激活LXRa，使其下游基因表達(dá)增加，從而調(diào)節(jié)膽固醇代謝，使血總膽固醇和肝膽固醇水平下降從而改善肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能?未見報(bào)道。 為此，本研究一方面以鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過肝組織形態(tài)學(xué)直接觀察，和血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的測(cè)定，確定糖尿病大鼠肝功能損傷的同時(shí)，觀測(cè)糖尿病大鼠肝膽固醇含量；用RT-PC

5、R方法，測(cè)定肝組織中PPARa、脂酰CoA氧化酶(ACOX1)以及LXRa、ABCA1、SR-BI、CYP7A1等與膽固醇代謝有關(guān)的基因表達(dá)情況；另一方面，觀察PPARa人工合成的激活配體，降脂藥一非諾貝特，對(duì)上述各項(xiàng)指標(biāo)的影響，了解糖尿病肝膽固醇代謝情況，進(jìn)一步探討糖尿病肝臟脂代謝紊亂的分子機(jī)理，深化對(duì)糖尿病脂代謝紊亂的認(rèn)識(shí)。 方法： 1、動(dòng)物分組及取材選用成年200-250g雄性清潔級(jí) Wistar大鼠，隨機(jī)分為：正

6、常對(duì)照組(CON)、糖尿病組(DM)、糖尿病+非諾貝特組(DM+F)、正常對(duì)照+非諾貝特組(CON+F)。正常大鼠一次性腹腔注射2％STZ誘導(dǎo)糖尿病發(fā)生。CON+F組和DM+F組在糖尿病大鼠模型建立后4周末，分別用生理鹽水和非諾貝特連續(xù)兩周給正常和STZ鼠灌胃(100mg/kg/day)。頸動(dòng)脈采空腹血，血清用于血糖、血脂、血膽汁酸、血谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的測(cè)定。肝臟用于組織切片、RNA及脂質(zhì)提取。 2、

7、光鏡觀察組織病理變化按常規(guī)方法將肝組織用甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色后，光鏡觀察。 3、肝臟總脂提取參照文獻(xiàn)<'[12]>提取肝臟總脂，用于膽固醇測(cè)定。 4、血糖、血脂、血膽汁酸、血ALT、血AST、肝膽固醇的測(cè)定上述指標(biāo)用Olympus Au2700型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。 5、肝組織有關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定用Trizol法提取總RNA。以GAPDH作為內(nèi)參，用RT-PCR法測(cè)定PPARa、ACO

8、X1、LXRa、ABCA1、SR-BI及CYP7A1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。 結(jié)果： 1、正常對(duì)照和糖尿病組各項(xiàng)指標(biāo)變化。 2、糖尿病+非諾貝特組和正常對(duì)照+非諾貝特組各項(xiàng)指標(biāo)變化。 結(jié)論： 1、糖尿病時(shí)，大鼠肝PPARa的激活伴隨LXRa的激活。糖尿病肝脂肪酸代紊亂時(shí)，與膽固醇代謝有關(guān)的基因表達(dá)也出現(xiàn)異常。 2、非諾貝特對(duì)糖尿病鼠肝膽固醇代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)影響不同于正常鼠。在我們實(shí)驗(yàn)