小鼠β-酪蛋白基因重組體構(gòu)建、表達(dá)及其產(chǎn)物的純化和酶解液的免疫功能研究.pdf

1、研究背景:乳源性的β-酪蛋白(β-CN)含有豐富的生物活性肽，這些生物活性肽在體內(nèi)發(fā)揮著各式各樣的生理功能，因此，β-酪蛋白被譽(yù)為乳蛋白中的戰(zhàn)略活性蛋白。制備和提取β-酪蛋白為研究β-酪蛋白及其中包含的生物活性肽具有重要的意義，也為開(kāi)發(fā)乳品奠定一定基礎(chǔ)。傳統(tǒng)方法獲得β-酪蛋白主要是從乳中分離純化，但獲得的β-酪蛋白產(chǎn)量較低，且分離純化難度較大，為β-酪蛋白的研究和開(kāi)發(fā)帶來(lái)不便。隨著生物技術(shù)飛速發(fā)展，利用基因工程手段直接獲得β-酪蛋白為人

2、們提供了新的思路和方法。各種哺乳動(dòng)物和人β-酪蛋白高度保守，尤其小鼠β-酪蛋白與人的β-酪蛋白又有很高的同源性，本研究以小鼠β-酪蛋白作為研究對(duì)象。 目的:構(gòu)建小鼠β-酪蛋白基因重組體，在大腸桿菌內(nèi)誘導(dǎo)其表達(dá)，純化β-酪蛋白并研究其酶解液的部分功能。 方法:從哺乳期小鼠乳腺組織提取總RNA，通過(guò)RT-PCR獲得β-酪蛋白基因編碼序列，再與融合蛋白表達(dá)載體pGEX-KG連接，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-β-CN，將

3、其轉(zhuǎn)化到E．coli DH5α宿主內(nèi)，在20℃，用低濃度的IPTG進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的誘導(dǎo)，超聲破碎細(xì)菌后SDS-PAGE分析。利用β-酪蛋白基因重組體表達(dá)的融合蛋A氨基端帶有GST標(biāo)簽，用商品化的GST beads(Glutathione Sepharose 4B)，親和層析的方法純化β-CN融合蛋白。以純化的β-CN融合蛋白為底物，用胰蛋白酶、糜蛋白酶作用底物60min、90min、120min、150min，得到不同時(shí)間段的酶解液。通過(guò)體

4、內(nèi)和體外兩系列實(shí)驗(yàn)，觀察了β-CN融合蛋白酶解液對(duì)大鼠和小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。 結(jié)果:經(jīng)限制內(nèi)切酶酶切圖譜分析和DNA序列測(cè)定證實(shí)所構(gòu)建的質(zhì)粒pGEX-KG-β-CN，SDS-PAGE證實(shí)誘導(dǎo)表達(dá)后所獲得的融合蛋白分子量為52KD，表達(dá)量占菌體蛋白的12.4％R主要存在于上清液中。純化后產(chǎn)物經(jīng)胰蛋白酶、糜蛋白酶作用90min、120min，其對(duì)大鼠和小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化有明顯的促進(jìn)作用。 結(jié)論:成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pG