草魚IFN-γrel的重組表達﹑純化和免疫學功能研究.pdf

1、CD4+T淋巴細胞根據(jù)標志性轉(zhuǎn)錄因子和分泌的細胞因子不同，可分為Th1，Th2，Th17和Treg四個細胞亞群。Th1細胞亞群中標志性轉(zhuǎn)錄因子為T-bet，分泌的主要細胞因子是IFN-γ和IL-12。DC細胞產(chǎn)生的IFN-γ可以上調(diào)CD4+ T細胞中T-bet的轉(zhuǎn)錄水平，進而促進CD4+ T細胞向Th1細胞分化，同時T-bet能結(jié)合在IFN-γ的啟動子上增強Th1細胞自身進一步產(chǎn)生IFN-γ。然而在硬骨魚中存在兩個II型干擾素基因，IF

2、N-γ2和IFN-γrel（又名IFN-γ1），其中后者的免疫功能地位并不清楚。為了清楚草魚IFN-γrel的功能特性，本課題將草魚的IFN-γrel成熟肽編碼序列克隆至原核表達載體 pET30a(+)，通過多次優(yōu)化誘導表達體系，大量目的蛋白出現(xiàn)在包涵體中，進而嘗試透析復性，稀釋復性等多種方法以期獲得具有生物學活性的重組蛋白，但經(jīng)凝膠層析或親和層析純化得到純度較高的蛋白后，Real-time PCR結(jié)果分析顯示重組蛋白無法調(diào)節(jié)下游基因的

3、表達。故將IFN-γrel編碼區(qū)克隆至真核表達載體pcDNA3.1-myc-his，轉(zhuǎn)染細胞系HEK293細胞48小時后，收集并濃縮培養(yǎng)基，Western blotting分析表明IFN-γrel蛋白表達成功并分泌到胞外，Real-time PCR結(jié)果分析顯示真核表達的蛋白能夠上調(diào)草魚頭腎白細胞中IL-8的基因表達，證明重組蛋白具有生物學活性。鑒于Th1細胞亞群中IFN-γ和標志轉(zhuǎn)錄因子T-bet的密切關(guān)系，草魚T-bet被克隆和鑒定，