重組胎盤干擾素（IFN-τ）表達(dá)純化及其對U937細(xì)胞增殖影響的研究.pdf

1、近年來胎盤干擾素(interferontau，IFN-τ)作為新發(fā)現(xiàn)的一種Ⅰ型干擾素，越來越受到人們的重視。IFN-τ最初被稱為滋養(yǎng)層蛋白-1(trophoblastprotein-1,TP-1)或滋養(yǎng)層素(trophoblastin)，是反芻動物在懷孕早期由滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的一類蛋白質(zhì)，它是反芻動物母體妊娠識別孕體的信號，在黃體維持和妊娠建立過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。 IFN-τ屬于Ⅰ型干擾素，具有Ⅰ型干擾素的許多共同特性，具

2、有抗病毒、抗細(xì)胞增生、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能。但I(xiàn)FN-τ也有自身特點，與其他的干擾素不同，它僅在反芻動物懷孕早期由胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞在孕體植入前后的一段時間表達(dá)，無需病毒誘導(dǎo)；它顯現(xiàn)出強(qiáng)的抗HIV等逆轉(zhuǎn)錄病毒活性；對多發(fā)性硬化的動物模型有明顯的免疫抑制作用；它能夠作用于多種細(xì)胞，具有跨種系的特點；可以減少反芻動物的胚胎和胎兒的流產(chǎn)率；此外，高濃度IFN-τ表現(xiàn)出較其他Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)所沒有或較小的細(xì)胞毒性。基于其特有的抗病毒

3、活性及低細(xì)胞毒性，為許多疾病的治療帶來新的希望。 隨著IFN-τ在臨床研究工作的不斷深入，人們需要大量高純度、有活性IFN-τ用于疾病的治療研究。從反芻動物孕體內(nèi)可以獲得具有高度活性的IFN-τ，但是步驟繁瑣、產(chǎn)量較低。目前，在國外已經(jīng)有人通過大腸桿菌以融合蛋白的形式表達(dá)并純化出重組IFN-τ，亦有人通過酵母菌、昆蟲-桿狀病毒等表達(dá)并純化出重組IFN-τ。大腸桿菌可以高效表達(dá)IFN-τ成熟肽，由于IFN-τ以包涵體的形式表達(dá)，需

4、要進(jìn)行純化和復(fù)性，這是本實驗要解決的問題之一。 目前對IFN-τ抗黃體溶解以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、表達(dá)調(diào)控等機(jī)制已經(jīng)進(jìn)行了不同程度的研究；對抗逆轉(zhuǎn)錄病毒作用也作了大量的研究工作；該藥作為一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑治療多發(fā)性硬化，自1999年在美國已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ期臨床階段。另外，有文獻(xiàn)報道IFN-τ可以抑制牛的MDBK細(xì)胞、鼠L929細(xì)胞以及人的WISH細(xì)胞的增殖，但尚無文獻(xiàn)報道IFN-τ對腫瘤細(xì)胞的影響。本實驗旨在應(yīng)用純化并經(jīng)過復(fù)性的重組綿羊胎盤干

5、擾素(roIFN-τ)檢測其對急性粒單核細(xì)胞白血病細(xì)胞U937的影響。 研究目的： 本實驗的主要目的是建立有效的純化roIFN-τ的方法，以獲得大量高純度的roIFN-τ。另外，初步檢測roIFN-τ在體外對U937細(xì)胞增殖的影響及其可能的機(jī)制。 研究方法： 1、roIFN-τ的表達(dá)與純化 將重組質(zhì)粒pBV220轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌EcoliBL21，獲得了高效表達(dá)外源蛋白roIFN-τ的工程菌。在

6、30℃發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速和通氣量是培養(yǎng)基的容氧值保持在20％以上；利用2mol/L的NaOH和1mol/L的HCI調(diào)節(jié)pH值。以葡萄糖為碳源，酵母提取物和蛋白胨為氮源，補(bǔ)充養(yǎng)料。迅速升溫至42℃誘導(dǎo)表達(dá)，roIFN-τ以包涵體的形式存在。利用超聲裂解法破裂細(xì)菌，經(jīng)多次反復(fù)洗滌后收集包涵體，用含8mol/L尿素的包涵體溶解液溶解目的蛋白，利用飽和硫酸銨溶液初步沉淀和純化，再用尺寸排阻層析法純化出較高純度的roIFN-

7、τ。 2、roIFN-τ的體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性測定 取對數(shù)生長期的人類單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株U937細(xì)胞加入不同濃度的roIFN-τ，應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)還原法檢測roIFN-τ對U937細(xì)胞的生長抑制率，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及fas、fasl和bcl-2凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。 研究結(jié)果： 1、發(fā)酵誘導(dǎo)4小時后的菌體用15％的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，得到與預(yù)期

8、蛋白分子量大小一致(21KD)的特異條帶。包涵體溶解液經(jīng)過硫酸銨初步沉淀，再經(jīng)過凝膠過濾色譜層析純化出高純度的目的蛋白；純化樣品的SDS-PAGE電泳圖譜經(jīng)Totallab軟件分析可知roIFN-τ的純度達(dá)到98.52％。 2、根據(jù)MTT實驗結(jié)果可以看出roIFN-τ對U937細(xì)胞增殖有明顯抑制作用并呈劑量依賴性。0.445mg/ml、0.178mg/ml、0.089mg/ml和0.044mg/ml的roIFN-τ在作用48小時

9、后的生長抑制率分別是60.97％、41.31％、20.82％和8.15％。FCM實驗結(jié)果顯示roIFN-τ可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡(p＜.05)；并且影響細(xì)胞周期，將細(xì)胞周期阻滯在S期(p＜0.05)；roIFN-τ上調(diào)fasl和bcl-2的表達(dá)(p＜0.05)，但對fas的表達(dá)沒有明顯的影響(p＞0.05)。 結(jié)論： 本實驗建立了簡單可行的可獲得具有高純度的roIFN-τ純化方法。 體外實驗顯示roIFN-τ可以抑制U