NAFLD小鼠Th17通路變化及白藜蘆醇作用機(jī)制的初步探討.pdf

1、目的:1、建立非酒精性脂肪性肝病的動物模型。2、初步探討Th17通路在非酒精性脂肪性肝病中的作用及白藜蘆醇對其作用機(jī)制的初步研究。
　　方法:本實(shí)驗采取隨機(jī)-對照的研究方法。將SPF級雄性C57BL/6小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行隨機(jī)分組。(1)60只雄性C57BL/6小鼠，6-8周齡，自由攝食AIN93對照飼料7天后，隨機(jī)分為Control組、高脂飲食(Highfat diet，HFD)組及西方飲食(Western diet，WD)組

2、，Control組16只，HFD組及WD組分別22只。分別給予對照飼料、高脂飼料、高脂飼料加高糖飲用水(42g/L)，造模時間33周。從WD組中隨機(jī)抽取12只小鼠，每組6只，分別給予白藜蘆醇(resveratrol，Res)及羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose sodium，CMC)45mg/kg/day灌胃，繼續(xù)喂養(yǎng)6周后處死小鼠。(2)定期觀察小鼠的進(jìn)食、精神狀態(tài)及毛發(fā)光澤度等，每周測量小鼠體重并記錄。(3)

3、觀察各組小鼠肝臟外形變化，記錄肝重，計算并比較肝重指數(shù)。(4)應(yīng)用苦味酸-天狼猩紅及蘇木素-伊紅(hematoxylinand eosin，HE)染色觀察肝組織病理學(xué)的改變。(5)檢測血清白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL-17)、甘油三酯（Triglyceride，TG）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase，AST）及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanineaminotransferas

4、e，ALT)的變化情況。(6)應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR(Real-timefluorescent quantitation PCR, Real-time qPCR)方法檢測肝組織中TGF-βmRNA、IL-22 mRNA、RORγt mRNA及IL-17A mRNA的表達(dá)情況。(7)提取肝、脾組織中的淋巴細(xì)胞，行流式細(xì)胞學(xué)檢測，了解肝、脾組織中CD4/CD8比值及CD4+T細(xì)胞IL-17、RORγ t的表達(dá)情況。(8)應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方

5、法檢測肝臟組織中α-SMA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:(1) HE及苦味酸-天狼猩紅染色顯示，Control組肝臟肝細(xì)胞大小及排列正常;HFD組和WD組形成非酒精性脂肪性肝炎及肝纖維化，造模成功;與WD+CMC組比較，WD+Res組肝纖維化程度明顯減輕(P＜0.05)。(2)與Control組比較，HFD組和WD組血清ALT、AST及TG明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與HFD組比較，WD組ALT、AST升高，差異有統(tǒng)計學(xué)

6、意義(P＜0.05)，TG降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與WD+CMC組比較，WD+Res組血清ALT、AST及TG均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(3)Real-time QPCR:與Control組比較，WD和HFD組TGF-β、IL-22及RORtmRNA表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，HFD組IL-17 mRNA表達(dá)無明顯差異(P＞0.05);與HFD組比較，WD組TGF-β、IL-22、RO

7、Rγt及IL-17 mRNA表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與WD+CMC組比較，WD+Res組TGF-β、IL-22、RORγt及IL-17 mRNA表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(4)血清IL-17:與Control組比較，HFD組及WD組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);WD組較HFD組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與WD+CMC組比較，WD+Res組IL-17表達(dá)量明顯降低，差

8、異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(5)流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果:肝臟:與Control組及HFD組比較，WD組CD4/CD8比值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，Control組與HFD組比較CD4/CD8比值無明顯差異(P＞0.05);與Control組比較，HFD組及WD組CD4+T RORγ t表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且WD組較HFD組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與WD+CMC組比較，WD+Res組C

9、D4/CD8比值及CD4+T RORγt表達(dá)量明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05); CD4+T IL-17的表達(dá)量在治療前后各組間均無明顯表達(dá)。脾臟:CD4/CD8比值、CD4+T RORγt及CD4+T IL-17表達(dá)量在治療前后均無明顯變化。(6)免疫組化:α-SMA:與Control組比較，HFD組及WD組α-SMA表達(dá)量增高(P＜0.05)，且WD組明顯高于HFD組(P＜0.05);同WD+CMC組比較，WD+Res組表

10、達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、通過采用經(jīng)典的西方飲食，成功建立了NASH相關(guān)肝纖維化小鼠模型。
　　2、模型組血清及組織中IL-17表達(dá)升高，提示Th17通路在NAFLD進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。
　　3、果糖在NASH相關(guān)肝纖維化的形成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。
　　4、α-SMA、TGF-β、IL-22、IL-17及RORγt在NAFLD炎癥反應(yīng)及肝纖維化中均發(fā)揮了重要作用。