Th17在難治性Graves病中的作用機(jī)制.pdf

1、Graves?。℅D）是一種常見(jiàn)的自身免疫性疾病，機(jī)體中存在甲狀腺自身抗體及甲狀腺組織中有大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。CD4+T細(xì)胞在GD發(fā)病中起重要作用，Th17細(xì)胞是一類新的T細(xì)胞亞群，屬于CD4+效應(yīng)T細(xì)胞。Th17細(xì)胞主要效應(yīng)因子是IL-17，IL-17具有強(qiáng)大的致炎性，通過(guò)受體（IL-17R）介導(dǎo)炎性反應(yīng)，在許多炎性反應(yīng)和自身免疫性疾病中起重要作用。在GD患者中，特別是難治性GD患者其Th17細(xì)胞比例較緩解期GD 增高；在GD動(dòng)物模型

2、中發(fā)現(xiàn)，IL-17基因敲除的小鼠不產(chǎn)生甲亢，證實(shí)了Th17在GD發(fā)病中起一定的作用。PPAR γ激動(dòng)劑噻唑烷二酮類(TZD)，具有顯著的抗炎癥反應(yīng)的作用，并可抑制Th17細(xì)胞的分化。本實(shí)驗(yàn)研究Th17在難治性GD 發(fā)病中的作用，及PPAR γ激動(dòng)劑的干預(yù)作用，期望為GD的治療提供新的策略。
　　 一、 Th17、IL-17及IL-17R在Graves 病中的表達(dá)情況
　　 目的：研究GD不同疾病階段患者血清IL-17的水

3、平，Th17、IL-17及IL-17R與難治性GD免疫病理的關(guān)系。
　　 方法：1、ELISA 法檢測(cè)GD不同疾病階段患者（初發(fā)未治組38例，難治性GD組36例，緩解組34例，正常對(duì)照組37例）血清IL-17水平。2、免疫組織化學(xué)檢測(cè)難治性GD （13例）和正常甲狀腺組織（11例）中Th17細(xì)胞和IL-17R的表達(dá)。3、Real-time PCR 法測(cè)定甲狀腺浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞IL-17及甲狀腺細(xì)胞IL-17及IL-17R表達(dá)水平。4

4、、流式細(xì)胞儀及免疫熒光檢測(cè)甲狀腺細(xì)胞IL-17R的表達(dá)。
　　 結(jié)果：1、初發(fā)未治GD、難治性GD患者血清IL-17水平較正常人增高，難治性GD血清IL-17水平較初發(fā)未治GD 增高，緩解期GD與正常人相比血清IL-17水平無(wú)明顯增高。2、難治性GD 甲狀腺組織中浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的IL-17mRNA表達(dá)量較正常甲狀腺組織中分離的淋巴細(xì)胞高。3、難治性GD 甲狀腺組織浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中存在分泌IL-17的Th17細(xì)胞，難治性GD 甲狀腺細(xì)

5、胞存在IL-17R的表達(dá)，正常甲狀腺細(xì)胞則未檢出IL-17和IL-17R蛋白的表達(dá)。說(shuō)明Th17與難治性GD的免疫病理有關(guān)。
　　 二、IL-17對(duì)甲狀腺細(xì)胞生長(zhǎng)功能和炎癥因子表達(dá)的影響及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制
　　 目的：研究IL-17對(duì)正常和難治性GD患者甲狀腺細(xì)胞生長(zhǎng)和功能的影響，IL-17 單獨(dú)或聯(lián)合TSAb對(duì)甲狀腺細(xì)胞IL-17R及炎癥因子IL-6、CXCL10和ICAM-1表達(dá)的影響，及其參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　

6、　 方法：1、MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率。2、化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞T3、T4的分泌量。3、Real-time PCR 法測(cè)定甲狀腺細(xì)胞IL-6、CXCL10和ICAM-1基因表達(dá)。4、ELISA法檢測(cè)細(xì)胞IL-6、CXCL10表達(dá)。5、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞IL-17R、ICAM-1表達(dá)。6、Westernblot 法檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)通路蛋白P38MAPK、JNK、ERK1/2及NF-κB P65表達(dá)。7、免疫熒光檢測(cè)NF-κB p65 核轉(zhuǎn)移。

7、
　　 結(jié)果：1、IL-17對(duì)正常和難治性GD 甲狀腺細(xì)胞生長(zhǎng)和分泌T3、T4 功能無(wú)明顯影響。2、難治性GD 甲狀腺細(xì)胞IL-6、CXCL10及ICAM-1表達(dá)較正常甲狀腺細(xì)胞明顯增多。3、IL-17 可增強(qiáng)難治性GD 甲狀腺細(xì)胞IL-6、CXCL10和ICAM-1基因和蛋白的表達(dá)，呈時(shí)效和量效關(guān)系，但對(duì)正常甲狀腺細(xì)胞無(wú)影響。4、TSAb 可促進(jìn)難治性GD和正常甲狀腺細(xì)胞IL-6、CXCL10和ICAM-1表達(dá)。5、IL-17

8、與TSAb 聯(lián)合加強(qiáng)難治性GD和正常甲狀腺細(xì)胞IL-6、CXCL10和ICAM-1表達(dá)。6、IL-17對(duì)兩種甲狀腺細(xì)胞IL-17R的表達(dá)均無(wú)影響，TSAb 可以上調(diào)正常甲狀腺細(xì)胞膜IL-17R的表達(dá)，對(duì)難治性GD 甲狀腺細(xì)胞IL-17R表達(dá)無(wú)明顯影響。7、IL-17與IL-17R 結(jié)合后，可通過(guò)P38MAPK及NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)難治性GD 甲狀腺細(xì)胞炎癥因子的分泌。
　　 三、 PPAR γ激動(dòng)劑吡格列酮對(duì)IL-17作用下難

9、治性GD 甲狀腺細(xì)胞的干預(yù)及相關(guān)機(jī)制
　　 目的：研究吡格列酮對(duì)IL-17作用下難治性GD 甲狀腺細(xì)胞的IL-6、CXCL10和ICAM-1表達(dá)的影響及其與MAPK、NF-κB信號(hào)通路的關(guān)系。
　　 方法：1、MTT 法檢測(cè)甲狀腺細(xì)胞存活率。2、Real-time PCR 法測(cè)定甲狀腺細(xì)胞IL-6、CXCL10和ICAM-1基因表達(dá)。3、ELISA、流式細(xì)胞儀檢測(cè)IL-6、CXCL10和ICAM-1蛋白的表達(dá)。4、Wes

10、ternblot 法檢測(cè)吡格列酮干預(yù)下P38MAPK、JNK、ERK1/2及NF-κB的變化情況。
　　 結(jié)果：1、0-50μM的吡格列酮對(duì)難治性GD 甲狀腺細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，100μM 吡格列酮可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。2、吡格列酮（0-50μM）可抑制IL-17作用下難治性GD 甲狀腺細(xì)胞IL-6、CXCL10分泌及ICAM-1表達(dá)，呈量效關(guān)系；同時(shí)可抑制三者的基因表達(dá)。3、吡格列酮(10μM)可抑制IL-17 誘導(dǎo)的難治性GD 甲

11、狀腺細(xì)胞P38MAPK和NF-κB 炎癥信號(hào)的激活，但對(duì)JNK和ERK 無(wú)影響。
　　 結(jié)論:
　　 1、初發(fā)未治GD、難治性GD患者血清IL-17水平增高，且難治性GD患者血清IL-17水平高于初發(fā)未治GD患者；難治性GD 甲狀腺組織存在Th17細(xì)胞浸潤(rùn)及IL-17R的表達(dá)，證實(shí)Th17與GD 特別是難治性GD的發(fā)病及免疫病理有關(guān)。
　　 2、IL-17與IL-17R 結(jié)合后，可通過(guò)P38MAPK及NF-κB