白藜蘆醇對(duì)KA誘導(dǎo)的癲癇模型大鼠抗癲癇作用及機(jī)制的初步分析.pdf

1、目的：應(yīng)用腦立體定位技術(shù)在大鼠海馬CA3中心區(qū)域通過(guò)微量注射海仁藻酸(Kainateacid，KA)誘發(fā)癲癇，以此建立大鼠顳葉癲癇動(dòng)物模型，利用此模型做后繼的慢性藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，從行為學(xué)、顱內(nèi)腦電記錄和形態(tài)學(xué)三種形式變化上觀察并評(píng)價(jià)白藜蘆醇(Rcs)對(duì)KA誘導(dǎo)癲癇模型動(dòng)物的抗癲癇效果并初步分析其作用機(jī)制。 方法: 1.模型建立雄性Wistar大鼠，體重220至260克，清潔級(jí)。用立體定位儀在海馬CA3區(qū)(AP：-4.0 mm

2、，ML:4.4 mm,DV:3.8 mm)緩慢注射KA2.5μl(0.04g/μl)，約10min注射完畢，留針3min，縫合頭皮。按Racine分級(jí)法對(duì)癲癇發(fā)作進(jìn)行分級(jí)，發(fā)作級(jí)別達(dá)4或5級(jí)的大鼠用于進(jìn)一步的慢性藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組大鼠注射等量的生理鹽水。 2.動(dòng)物分組將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為五組：即正常生理鹽水假手術(shù)組(NS組)、KA+溶劑對(duì)照組(VS組，)、KA+丙戊酸鈉組(VPA組，300mg/kg/d)、KA+白藜蘆醇低劑量組(L

3、Res組，15mg/kg/d)和KA+白藜蘆醇高劑量組(HRes組，30mg/kg/d)。模型動(dòng)物在首次急性大發(fā)作后采用灌胃給藥，每天1次，持續(xù)10天。 3.行為學(xué)觀察將手術(shù)后的大鼠飼養(yǎng)于裝有視頻監(jiān)控的動(dòng)物房?jī)?nèi)，兩周后對(duì)各組大鼠進(jìn)行視頻監(jiān)控，每天監(jiān)控8小時(shí)，每周監(jiān)控5天，共監(jiān)控2個(gè)月，從行為表現(xiàn)上統(tǒng)計(jì)各組大鼠兩周后發(fā)生癲癇自發(fā)發(fā)作的個(gè)體數(shù)。 4.顱內(nèi)腦電記錄視頻監(jiān)控結(jié)束后，將各組大鼠麻醉并進(jìn)行顱內(nèi)腦電記錄，電極采用不銹鋼

4、電極，在左右海馬對(duì)稱位點(diǎn)各放置一根記錄電極，參考電極放置在前額葉硬腦膜上，每只大鼠記錄120分鐘，記錄結(jié)束后隨機(jī)抽取連續(xù)的30分鐘顱內(nèi)腦電圖(Intracalvarium electroencepholography recording，IEEG)進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)每只大鼠出現(xiàn)癲癇樣特征波的個(gè)數(shù)，分析各組大鼠癲癇樣特征波的數(shù)目差異。 5.形態(tài)學(xué)分析腦電記錄完畢后，對(duì)大鼠進(jìn)行內(nèi)灌注取腦，組織經(jīng)脫水處理后進(jìn)行冰凍切片，片厚20μm，并

5、進(jìn)行Nissl和Timm染色，Nissl染色用以評(píng)價(jià)各組大鼠海馬內(nèi)CAl、CA3和DG門(mén)區(qū)神經(jīng)元的損傷情況；Timm染色用以評(píng)價(jià)各組大鼠苔狀纖維發(fā)芽(Mossy fiber sprouting，MFS)的程度。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較各組大鼠癲癇自發(fā)發(fā)作率、30分鐘內(nèi)癇樣放電個(gè)數(shù)、神經(jīng)元丟失和MFS程度的差異，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。 結(jié)果: 1.行

6、為學(xué)結(jié)果NS組未見(jiàn)一只動(dòng)物有自發(fā)性癲癇發(fā)作；VS組12只中有9只(9/12)觀察到自發(fā)性發(fā)作：VPA組中7只大鼠僅有1只(1/7)有自發(fā)性發(fā)作；LRes組中7只大鼠有1只(1/7)有自發(fā)性發(fā)作；HRes組6只中有4只(4/6)有自發(fā)性發(fā)作。 2.腦電圖結(jié)果VPA(n=6，P<0.01)和LRes(n=7，P<0.01)組大鼠的癇樣放電明顯低于VS組(n=7，P<0.05)，且兩組所用的藥物對(duì)癇樣放電的抑制效應(yīng)相差無(wú)幾。HRes與

7、VS組的癇樣個(gè)數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3.形態(tài)學(xué)結(jié)果Nissl染色結(jié)果顯示VPA對(duì)海馬CAl區(qū)域的神經(jīng)元有一定的保護(hù)作用，對(duì)其他區(qū)域神經(jīng)元沒(méi)有保護(hù)作用(n=7，P<0.05)：低劑量Res對(duì)海馬CAl區(qū)神經(jīng)元保護(hù)作用較好，同時(shí)對(duì)CA3a區(qū)保護(hù)作用也很顯著(n=7，P<0.05)，但對(duì)CA3的其他區(qū)區(qū)域和齒狀回(DG)門(mén)區(qū)的神經(jīng)元保護(hù)作用與溶劑對(duì)照組(VS組)相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；高劑量Res對(duì)海馬各區(qū)神經(jīng)元的保護(hù)作用均不明顯。Ttrnm染

8、色結(jié)果顯示VS組大鼠苔蘚纖維侵入顆粒細(xì)胞層和內(nèi)分子層。在生理鹽水對(duì)照組(NS組)未觀察到神經(jīng)元的丟失和苔蘚纖維發(fā)芽(MFS)。低劑量Res和VPA對(duì)MFS具有明顯地抑制作用(n=7，P<0.05)，且低劑量Res對(duì)MFS的抑制作用好于VPA組(n=7，P<0.05)；高劑量Res對(duì)苔狀纖維發(fā)芽的幾乎沒(méi)有抑制效果。 結(jié)論: 1.VPA對(duì)KA誘導(dǎo)的癲癇模型大鼠海馬CAl區(qū)神經(jīng)元具有保護(hù)作用，同時(shí)對(duì)MFS表現(xiàn)一定的抑制效應(yīng)。