實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血對大鼠行為和海馬結(jié)構(gòu)的影響.pdf

1、蛛網(wǎng)膜下腔出血（Subarachnoid hemorrhage，SAH），是一種臨床常見的危重病癥，泛指腦底部或腦表面的病變血管破裂，血液直接流入蛛網(wǎng)膜下腔引起的一種臨床綜合征。根據(jù)出血部位和出血量的不同，治療效果差異很大。SAH常見的并發(fā)癥有，再出血、腦血管痙攣和急慢性腦積水（hydrocephalus）等。有些SAH的幸存者，可出現(xiàn)進(jìn)行性腦室增大、腦皮質(zhì)萎縮和認(rèn)知功能障礙甚至變得癡呆。阿爾茲海默病（Alzheimer's disea

2、se）簡稱AD，又稱早老性或老年性癡呆，是臨床上最為常見的癡呆類型。相繼的研究發(fā)現(xiàn)，它是一種以進(jìn)行性學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾??；目前對其發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，也無明確有效的防治方法。我們好奇，是否這種SAH后遺癥的發(fā)生，與AD的發(fā)生和發(fā)展存在相似的病理機(jī)制?
　　眾所周知，正常的腦脊液（Cerebrospinal fluid,CSF）循環(huán)，對于腦組織代謝產(chǎn)物，尤其是脂質(zhì)、蛋白等大分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，維持中樞

3、神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定，發(fā)揮著難以替代的作用。所以有理由推測，是否由于不同原因引起的慢性CSF循環(huán)障礙或腦積水，導(dǎo)致了腦組織代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)異常，誘發(fā)了腦組織出現(xiàn)病理性變化和功能受損？本研究模擬蛛網(wǎng)膜下腔出血，建立慢性CSF循環(huán)障礙的大鼠模型，觀察和檢測實(shí)驗(yàn)動物的行為變化、海馬皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)線粒體跨膜電位、以及海馬皮質(zhì)、側(cè)腦室室管膜和脈絡(luò)叢的細(xì)微和超微結(jié)構(gòu)變化，檢測海馬皮質(zhì)內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)的變化等。本實(shí)驗(yàn)研究分為以下三部分。
　　第一

4、部分：實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠模型的建立和對其行為影響的觀察
　　目的：
　　本部分研究實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）繼發(fā)的腦損傷，對大鼠認(rèn)知功能產(chǎn)生的傷害性影響，為實(shí)驗(yàn)性SAH對海馬皮質(zhì)、側(cè)腦室室管膜以及脈絡(luò)叢損傷機(jī)制的研究，提供行為學(xué)證據(jù)。
　　方法：
　　選取成年SD大鼠60只，平均體重為300.40±44.50 g，雌雄不拘；將60只大鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對照組，各組30只。試驗(yàn)組大鼠用10％的水合氯醛進(jìn)行

5、腹腔注射麻醉后，向腦枕大池（或稱小腦延髓池）內(nèi)注入自體動脈血0.30 ml,制作模擬SAH的實(shí)驗(yàn)動物模型；對照組大鼠只是向枕大池內(nèi)注射等量生理鹽水，其余操作步驟同試驗(yàn)組。同時，對試驗(yàn)組和對照組大鼠（各10只），術(shù)后進(jìn)行常規(guī)喂養(yǎng)，并于術(shù)后2個月、4個月、6個月時，進(jìn)行一般行為學(xué)統(tǒng)計分析、神經(jīng)功能整體評分和行為學(xué)研究三個方面的測試，統(tǒng)計和分析相關(guān)數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果：
　　與對照組相比，試驗(yàn)組大鼠術(shù)后出現(xiàn)精神萎靡不振、嗜睡、飲食減少

6、，肢體活動力減低等神經(jīng)功能缺損的表現(xiàn)，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；并且隨著飼養(yǎng)時間的延長，這種現(xiàn)象更加明顯，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；在 Morris水迷宮試驗(yàn)的測試中，與對照組相比，試驗(yàn)組大鼠的空間學(xué)習(xí)能力以及記憶能力明顯下降，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；并且隨著飼養(yǎng)月份的延長，試驗(yàn)組大鼠的學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知功能和活動能力逐漸減退，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　第二部分：實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血誘發(fā)大鼠海

7、馬皮質(zhì)和側(cè)腦室室管膜及脈絡(luò)叢的形態(tài)學(xué)變化
　　目的：
　　本部分研究主要通過光鏡、電鏡和流式細(xì)胞術(shù)，觀察實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH），誘發(fā)大鼠海馬皮質(zhì)、側(cè)腦室室管膜及脈絡(luò)叢的形態(tài)學(xué)變化，海馬皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)線粒體跨膜電位（MTP）的變化，為實(shí)驗(yàn)性SAH對大鼠海馬皮質(zhì)、側(cè)腦室室管膜及脈絡(luò)叢的損傷機(jī)制，提供實(shí)驗(yàn)形態(tài)學(xué)證據(jù)。
　　方法：
　　選取成年SD大鼠90只，平均體重為300.20±27.50 g，雌雄不拘；將9

8、0只大鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對照組，每組各45只。試驗(yàn)組大鼠用10%的水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉后，向腦枕大池內(nèi)注入其自體動脈血液0.30 ml，制作模擬SAH的實(shí)驗(yàn)動物模型；對照組大鼠只是向枕大池內(nèi)注射等量生理鹽水，其余操作步驟同試驗(yàn)組。試驗(yàn)組和對照組大鼠（各取10只）術(shù)后進(jìn)行常規(guī)喂養(yǎng)，并于術(shù)后2個月、4個月、6個月時，通過主動脈灌注固定取材，進(jìn)行光鏡、掃描和透射電鏡樣品的制備；同時每組隨機(jī)取5只大鼠，通過深度麻醉下斷頭取腦的方法剝離雙側(cè)海

9、馬，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測海馬皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)MTP；通過熒光顯微鏡拍照，觀察海馬皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況；比較試驗(yàn)組與對照組大鼠海馬皮質(zhì)、側(cè)腦室室管膜及脈絡(luò)叢，在光鏡、掃描和透射電鏡下的細(xì)微和超微結(jié)構(gòu)差異，以及兩組大鼠海馬皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)MTP的差異，揭示實(shí)驗(yàn)性SAH對大鼠相關(guān)腦組織結(jié)構(gòu)的影響，為行為變化提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。
　　結(jié)果：
　　試驗(yàn)組：光鏡觀察顯示，隨著術(shù)后飼養(yǎng)月份的增加，大鼠側(cè)腦室逐漸增大，室管膜細(xì)胞由立方形變?yōu)槎嘈涡陨?/p>

10、至扁平形；海馬皮質(zhì)表面的室管膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)細(xì)微改變，在海馬槽和多形細(xì)胞層，可觀察到小血管周圍間隙明顯增寬，錐體細(xì)胞層明顯變薄，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞排列紊亂；并且，飼養(yǎng)時間越長，這種現(xiàn)象越明顯。掃描電鏡觀察顯示，在脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞表面，出現(xiàn)大量火山口樣凹陷，其絨毛萎縮、扭曲甚至脫落；在海馬皮質(zhì)被覆的室管膜細(xì)胞表面，其纖毛和微絨毛明顯減少。透射電鏡觀察顯示，脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞可見大量的吞飲泡，胞體和胞核呈現(xiàn)不規(guī)則狀；海馬皮質(zhì)錐體細(xì)胞核內(nèi)的異染色質(zhì)明顯增

11、多，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)膨大的線粒體、神經(jīng)原纖維纏結(jié)的團(tuán)塊，在神經(jīng)氈內(nèi)的淀粉樣脂蛋白沉積等現(xiàn)象；在術(shù)后飼養(yǎng)到6個月時，這種現(xiàn)象更為明顯；表現(xiàn)為海馬室管膜細(xì)胞表面的微絨毛減少更明顯，大量的淀粉樣脂蛋白沉積在血管周圍。JC-1流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，海馬皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)MTP去極化現(xiàn)象嚴(yán)重，與對照組相比，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)線粒體發(fā)生不同程度的病理變化，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯；并且隨著飼養(yǎng)時間的延長，這種現(xiàn)象逐漸加重,P<0.05，差

12、異具有統(tǒng)計學(xué)意義。然而在對照組：術(shù)后2個月、4個月甚至6個月，大鼠的海馬皮質(zhì)、側(cè)腦室室管膜及脈絡(luò)叢，以及海馬皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)MTP，均未觀察到明顯的病理變化。
　　第三部分：實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠海馬皮質(zhì)內(nèi)炎性和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的變化
　　目的：
　　以上述兩部分的研究為基礎(chǔ)，通過免疫組織化學(xué)法、Western blot以及TUNEL檢測法，進(jìn)一步探討實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH），對大鼠與學(xué)習(xí)、記憶相關(guān)的重要腦區(qū)—海

13、馬皮質(zhì)內(nèi)炎性和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，揭示實(shí)驗(yàn)性SAH與AD之間的關(guān)聯(lián)性。
　　方法：
　　選取成年SD大鼠90只，平均體重為289.40±45.50 g，雌雄不拘；隨機(jī)將大鼠分為試驗(yàn)組和對照組，每組各45只。試驗(yàn)組大鼠用10%的水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉后，向枕大池內(nèi)注入自體動脈血0.30 ml,制作模擬SAH的實(shí)驗(yàn)動物模型；對照組大鼠只是向枕大池內(nèi)注射等量生理鹽水，其余操作步驟同試驗(yàn)組。同時，對試驗(yàn)組和對照組大鼠進(jìn)行常規(guī)喂

14、養(yǎng)，并于術(shù)后2個月、4個月、6個月時，隨機(jī)每組取10只大鼠，經(jīng)主動脈灌注固定取材，石蠟切片，通過免疫組織化學(xué)染色法，觀察Aβ，IL-1β，IBA-1在海馬皮質(zhì)的表達(dá)情況；采用TUNEL檢測法，觀察大鼠海馬皮質(zhì)錐體細(xì)胞的凋亡情況。同時隨機(jī)每組取5只大鼠，在深度麻醉下快速斷頭取腦，剝離大鼠雙側(cè)海馬皮質(zhì)結(jié)構(gòu)，通過Westernblot法，檢測炎性相關(guān)蛋白IL-1β、自噬相關(guān)蛋白（Atg-5, Beclin-l和LC-3），在大鼠海馬皮質(zhì)的表達(dá)

15、；記錄并分析相關(guān)數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果:
　　1.Western blot結(jié)果分析：與對照組相比，試驗(yàn)組大鼠海馬皮質(zhì)炎性相關(guān)蛋白IL-1β、自噬相關(guān)蛋白（Atg-5, Beclin-l和LC-3）的表達(dá)明顯增多，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；并且隨著術(shù)后飼養(yǎng)時間的延長表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:與對照組相比，試驗(yàn)組大鼠在實(shí)驗(yàn)性SAH術(shù)后，海馬皮質(zhì)內(nèi)Aβ、IL-1β、

16、IBA-1的表達(dá)明顯增多，并且隨著術(shù)后飼養(yǎng)時間的延長呈現(xiàn)上升趨勢。
　　3.TUNEL檢測結(jié)果表明：在實(shí)驗(yàn)性SAH術(shù)后，與對照組相比，試驗(yàn)組大鼠的海馬皮質(zhì)內(nèi)錐體細(xì)胞凋亡現(xiàn)象增多，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，并且隨著術(shù)后飼養(yǎng)時間的延長而逐漸加重，術(shù)后飼養(yǎng)6個月時達(dá)高峰，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.采用枕大池單次注射微量自體動脈血的方法，可以成功復(fù)制模擬SAH的實(shí)驗(yàn)大鼠模型，其病理變化與行

17、為表現(xiàn)相一致，具有較為可靠的基礎(chǔ)和臨床研究參考意義。
　　2.實(shí)驗(yàn)性SAH可導(dǎo)致試驗(yàn)組大鼠的學(xué)習(xí)、記憶以及活動能力明顯減退，并且隨著術(shù)后飼養(yǎng)時間的延長，病情逐漸加重；提示實(shí)驗(yàn)性SAH可能對大鼠側(cè)腦室室管膜、脈絡(luò)叢、海馬皮質(zhì)等結(jié)構(gòu)，造成了不同程度的病理性損傷。
　　3.實(shí)驗(yàn)性SAH可誘發(fā)大鼠海馬皮質(zhì)、側(cè)腦室室管膜以及脈絡(luò)叢的細(xì)微和超微結(jié)構(gòu)變化，誘發(fā)海馬皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)MTP去極化，出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡或壞死增多現(xiàn)象。
　　4.