通用stem-loop引物方法篩查和定量檢測免疫抑制患者的microRNA.pdf

1、目的:
　　RT-qPCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于microRNA(miRNA)表達定量，其中stem-loop RT-PCR技術(shù)使用最為頻繁，但是該方法耗時耗試劑，并且不利于快速篩選miRNA。因此我們欲建立一種能快速篩選和定量miRNA的新方法。
　　方法:
　　1、本論文建立了一種新的稱為“通用stem-loop引物”(USLP)方法，該方法將傳統(tǒng)stem-loop(TSLP)的3'端的特異性片段替換成8個隨機堿基，使其能

2、快速篩選和定量miRNA。
　　2、設(shè)計了三個實驗測試USLP方法的敏感性、特異性和重復(fù)性;
　　1)將合成的miR-155標(biāo)準(zhǔn)品十倍梯度稀釋7個數(shù)量級（109-103拷貝/μL），并將稀釋后的不同濃度的miR-155作為模板進行qRT-PCR以觀測方法的敏感性;
　　2)將PCR產(chǎn)物通過3％瓊脂糖凝膠電泳、溶解曲線和測序三種方法共同驗證USLP方法的特異性;
　　3)選取3個濃度梯度的合成miR-155標(biāo)準(zhǔn)品（

3、108-106拷貝/μL）進行qRT-PCR重復(fù)實驗二十次，用以驗證新方法的重復(fù)性;
　　3、將29例健康體檢和58例服用FK506（免疫抑制劑）的腎移植患者的T淋巴細胞激活培養(yǎng)，通過比較USLP和TSLP兩方法在T淋巴細胞激活的不同時間段（0h、24h、48h和72h）的miRNA表達變化，來判斷新方法的實際應(yīng)用情況。
　　結(jié)果:
　　1、通過使用Primer5軟件成功設(shè)計用于RT的通用stem-loop引物、以及相

4、應(yīng)的qPCR引物，包括特異性的正向引物和通用反向引物。
　　2、USLP方法的敏感性、特異性和重復(fù)性結(jié)果:
　　1)敏感性:最低可以檢測到103拷貝/μL的模板RNA。
　　2)特異性:通過分析溶解曲線、瓊脂糖凝膠電泳和測序結(jié)果，可以得出USLP和TSLP方法的PCR后產(chǎn)物單一且為目的產(chǎn)物。
　　3)重復(fù)性:CV值＜2.5％，說明USLP方法的高重復(fù)性。
　　3、健康體檢和服用FK506的腎移植患者外周血的

5、T淋巴細胞刺激培養(yǎng)不同階段的miRNA表達變化:
　　1)使用USLP方法發(fā)現(xiàn)，miR-150-5p（miR-150）和miR-155-5p（miR-155）隨著T淋巴細胞刺激培養(yǎng)時間延長出現(xiàn)表達變化:miR-150在72h時表達降到最低，降低了約10倍;miR-155在72h時表達升高到最高，升高近7倍。
　　2) USLP檢測在T細胞激活過程中miR-150與miR-155表達變化趨勢與TSLP方法一致。
　　3)