GPV感染鵝免疫組織中病毒的檢測及免疫抑制的研究.pdf

1、小鵝瘟(Gosling plague,GP)又稱鵝細(xì)小病毒病(Goose parvovirus infection),是由鵝細(xì)小病毒引起的雛鵝急性敗血性傳染病。1956年我國方定一在揚(yáng)州首次發(fā)現(xiàn)小鵝瘟病毒(GPVirus,GPV),1971年Schettler確定這種病是由細(xì)小病毒引起的。1978年WPA又建議把這種病稱為鵝細(xì)小病毒感染。病原定名為鵝細(xì)小病毒(GPV)。GPV侵害4～20日齡雛鵝及雛番鴨(Muscovy Duckling

2、s),傳染性強(qiáng)、傳播迅速、死亡率達(dá)90％,GPV感染雛鵝后,各組織器官均呈現(xiàn)廣泛的病理損傷,病變較為嚴(yán)重的為小腸,其次為免疫系統(tǒng),其他各組織器官也出現(xiàn)相應(yīng)的病變。GPV感染給養(yǎng)鵝業(yè)帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)小鵝瘟開展的大量了研究并取得了一定的進(jìn)展,但是在發(fā)病機(jī)制方面的研究還甚少。
　　 本研究應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆小鵝瘟病毒VP3基因,之后利用基因工程技術(shù)在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了VP3蛋白并制備出了多克隆抗體;應(yīng)用PCR方法

3、和免疫組化方法檢測了GPV感染雛鵝脾臟、法氏囊、胸腺中的病毒分布;同時(shí)也檢測了脾臟、法氏囊、胸腺中IL-8、IL-18、IFN-α、IFN-γ,mRNA和PPAR-γmRNA表達(dá)量的變化,結(jié)果表明:
　　 1根據(jù)GenBank發(fā)表的GPVB株全基因序列,應(yīng)用Oligo6.0與PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物,采用PCR技術(shù)克隆GPVVP3基因,并將VP3基因插入到原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-1的BamHⅠ、Xho

4、Ⅰ多克隆位點(diǎn)之間,將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-VP3轉(zhuǎn)化到Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中,獲得了表達(dá)VP3基因的陽性亞克隆重組子,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),VP3基因在原核表達(dá)菌Rosetta中獲得高效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物約83KD的GST-VP3融合蛋白。
　　 2利用重組蛋白免疫8周齡Balb/c鼠,成功制備出抗GPV的多克隆抗體并用間接ELISA方法檢測抗體效價(jià),效價(jià)達(dá)到1:25600,采用Western-blot檢測出多克隆抗體對(duì)

5、于融合蛋白具有特異性。
　　 3在小鵝瘟病毒感染后2d、4d、6d、8d,通過PCR和免疫組化法在雛鵝脾臟、法氏囊、胸腺均能檢測到病毒。各組織中病毒的分布規(guī)律有所差別,隨著時(shí)間的延長病毒的含量也有所變化。在感染后4d～6d病毒載量達(dá)高峰。
　　 4GPV感染后能引起免疫組織結(jié)構(gòu)的損傷,并不同程度的影響脾臟、法氏囊和胸腺內(nèi)IL-8、IL-18、IFN-α、IFN-γmRNA的表達(dá)水平。在病毒感染的前期,脾臟、法氏囊和胸腺I

6、L-8、IL-18、IFN-α、IFN-γmRNA表達(dá)量有升高的趨勢,而到第8d免疫組織中上述基因mRNA表達(dá)量均驟然降低,且均低于對(duì)照組,表明GPV感染后引起了雛鵝的免疫抑制。
　　 5通過對(duì)胸腺、脾臟、法氏囊、PPAR-γ基因mRNA表達(dá)的檢測,首次證實(shí)雛鵝PPAR-γ基因表達(dá)于胸腺、脾臟與法氏囊。同時(shí)證明小鵝瘟病毒感染可以影響PPAR-γ基因在雛鵝胸腺、脾臟、法氏囊、內(nèi)的表達(dá),而且PPAR-γ基因?qū)υ诓《靖腥镜牟煌瑫r(shí)期、不