肺癌細(xì)胞FAAP20和RAD51C基因敲減對順鉑敏感性的影響.pdf

1、目的:應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)分別和同時共敲減人肺腺癌Calu-1細(xì)胞中范可尼貧血（Fanconi anemia, FA）通路FAAP20基因和RAD51C基因，觀察該細(xì)胞這兩個基因敲減后對順鉑敏感性的變化，探討抑制FA通路DNA的損傷修復(fù)功能逆轉(zhuǎn)Calu-1細(xì)胞對順鉑（cisplatin，DDP）耐藥性的可行性及其效應(yīng)，并探究FA通路在Calu-1細(xì)胞株對順鉑的耐藥機(jī)制中所起的作用。
　　方法：將針對 FAAP20基因和 RAD5

2、1C基因的siRNAs（FAAP20-siRNA和RAD51C-siRNA），用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將它們分別和同時共轉(zhuǎn)染于人肺腺癌細(xì)胞Calu-1細(xì)胞。蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting，WB）檢測經(jīng) siRNAs轉(zhuǎn)染前后Calu-1細(xì)胞FA通路FAAP20和RAD51C蛋白的表達(dá)量的變化以證明轉(zhuǎn)染效率，并測定FANCD2蛋白的單泛素化水平；CCK-8(Cell Counting Kit-8)法測定分別和同時共轉(zhuǎn)染前后Calu-

3、1細(xì)胞增殖率的變化；Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)測定分別和同時共轉(zhuǎn)染前后 Calu-1細(xì)胞早期凋亡率的變化；免疫熒光法測定分別和同時共轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞核內(nèi)FANCD2核聚小體的形成。
　　結(jié)果：與未轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染FAAP20-siRNA組和RAD51C-siRNA組后經(jīng)順鉑處理的Calu-1細(xì)胞FA通路中FAAP20蛋白和RAD51C蛋白表達(dá)量均明顯降低（P均<0.05），證明轉(zhuǎn)染FAAP20-siRNA和RAD51C-siR

4、NA有效，這兩種基因被成功敲減。敲減 FAAP20基因后，肺腺癌 Calu-1細(xì)胞中經(jīng)順鉑處理誘導(dǎo)的FANCD2蛋白單泛素化水平顯著降低，且形成的FANCD2核聚小體明顯下降（P<0.05）。而敲減RAD51C基因后，肺腺癌Calu-1細(xì)胞中經(jīng)順鉑誘導(dǎo)的FANCD2蛋白的單泛素化水平和核聚小體的形成并沒有明顯改變（P>0.05），證實(shí)了FAAP20蛋白作用在FA通路上游，而RAD51C蛋白在FA通路下游行使功能。無論Calu-1細(xì)胞的F

5、AAP20基因和RAD51C基因被敲減之前或之后，順鉑處理后的Calu-1細(xì)胞增殖率均隨濃度升高而下降，呈劑量依賴性。這兩個基因敲減之后經(jīng)順鉑處理的細(xì)胞增殖率較基因敲減之前明顯下降（P<0.05），細(xì)胞早期凋亡率較敲減之前明顯增高，而這兩個基因同時共敲減較單基因敲減進(jìn)一步增強(qiáng)了Calu-1細(xì)胞對順鉑的敏感性。
　　結(jié)論：利用siRNA干擾技術(shù)分別敲減肺腺癌細(xì)胞Calu-1細(xì)胞株FAAP20基因和RAD51C基因可抑制FA通路的DN