青蒿琥酯通過下調(diào)同源重組蛋白R(shí)AD51增加卵巢癌細(xì)胞對化療藥物順鉑的敏感性.pdf

1、卵巢癌為婦科生殖器官常見惡性腫瘤之一，死亡率居?jì)D科腫瘤首位。目前，對于卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療是最佳減瘤手術(shù)配合鉑類化療藥物的組合治療。但由于缺乏有效的早期診斷手段和腫瘤對常規(guī)化療藥物的耐藥性，卵巢癌治療效果并不顯著，如何提高化療藥物對卵巢癌的治療效果，是醫(yī)學(xué)上亟待解決的問題。
　　青蒿琥酯是從中藥青蒿中提取的一種倍半萜內(nèi)酯類化合物，是目前治療重癥瘧疾的首選藥物。近年來的研究表明，青蒿琥酯可以通過升高腫瘤細(xì)胞活性氧(ROS)和DNA損傷水

2、平，誘導(dǎo)細(xì)胞走向凋亡和細(xì)胞周期阻滯等多種途徑，達(dá)到抑制腫瘤生長的效果。且相比于野生型的細(xì)胞，堿基切除修復(fù)(Base excision repair,BER)和同源重組修復(fù)(Homologous recombination，HR)缺陷的細(xì)胞對青蒿琥酯更為敏感，說明青蒿琥酯誘導(dǎo)的DNA損傷主要由BER和HR途徑完成修復(fù)。
　　同源重組修復(fù)可以修復(fù)多種DNA損傷，包括雙鏈DNA斷裂和鏈間交聯(lián)。RAD51蛋白是HR修復(fù)過程中的關(guān)鍵蛋白，負(fù)

3、責(zé)催化同源DNA鏈間的交換。RAD51在多種腫瘤中高表達(dá)，由此所導(dǎo)致的DNA修復(fù)能力的增強(qiáng)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對放療、化療和靶向治療等多種治療產(chǎn)生耐受。因而下調(diào)RAD51蛋白表達(dá)水平有望會(huì)克服腫瘤的化療和放療耐受。本課題研究了青蒿琥酯對卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用以及青蒿琥酯對RAD51的負(fù)調(diào)控作用。結(jié)果顯示，青蒿琥酯既能誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的DNA雙鏈斷裂，又能下調(diào)同源重組蛋白R(shí)AD51的表達(dá)，后一功能顯著增加了卵巢癌細(xì)胞對化療藥物順鉑的敏感性。
　

4、　[研究目的]
　　本課題以卵巢癌細(xì)胞和小鼠體內(nèi)移植瘤為模型，研究聯(lián)合青蒿琥酯和順鉑的抗腫瘤作用及其機(jī)制。
　　[研究方法]
　　一、利用CCK-8方法檢測青蒿琥酯對人卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制作用。
　　二、利用Annexin Ⅴ和PI雙染法檢測青蒿琥酯處理卵巢癌細(xì)胞的凋亡情況。
　　三、利用流式細(xì)胞術(shù)檢測青蒿琥酯處理卵巢癌細(xì)胞后ROS水平變化情況。
　　四、利用平板克隆形成法檢測聯(lián)合青蒿琥酯和順鉑對卵巢

5、癌細(xì)胞生長的抑制作用。
　　五、利用Western blot和Real-time PCR技術(shù)檢測青蒿琥酯處理腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞RAD51，Parp-1，Ku80，XRCC1等相關(guān)損傷修復(fù)蛋白表達(dá)水平。
　　六、利用免疫熒光，Western blot方法檢測青蒿琥酯處理后，卵巢癌細(xì)胞γ-H2AX的焦點(diǎn)形成及蛋白表達(dá)。
　　七、利用免疫熒光檢測青蒿琥酯預(yù)處理卵巢癌細(xì)胞對RAD51焦點(diǎn)形成的影響。
　　八、利用裸鼠的體

6、內(nèi)卵巢癌移植瘤模型，評估聯(lián)合青蒿琥酯和順鉑治療卵巢癌的效果。
　　九、利用RAD51高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞系，進(jìn)一步確定青蒿琥酯的化療增敏作用由RAD51下調(diào)介導(dǎo)。
　　十、利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測青蒿琥酯對RAD51啟動(dòng)子活性的影響。
　　[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
　　一、青蒿琥酯通過誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡抑制細(xì)胞增殖，且具有劑量依賴性。
　　二、青蒿琥酯誘導(dǎo)卵巢癌ROS水平的上升和DNA雙鏈斷裂的產(chǎn)生。
　　三

7、、青蒿琥酯下調(diào)腫瘤細(xì)胞內(nèi)同源重組蛋白R(shí)AD51的表達(dá)，對正常細(xì)胞RAD51蛋白表達(dá)沒有影響。
　　四、青蒿琥酯處理下腫瘤細(xì)胞RAD51焦點(diǎn)形成受阻。
　　五、青蒿琥酯能增加順鉑對卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用，聯(lián)合青蒿琥酯和順鉑對卵巢癌抑制作用具有明顯的協(xié)同效應(yīng)。
　　六、異位高表達(dá)RAD51可降低聯(lián)合青蒿琥酯和順鉑對卵巢癌的殺傷作用。
　　七、青蒿琥酯增加體內(nèi)順鉑治療卵巢癌效果，聯(lián)合用藥明顯抑制了卵巢癌移植瘤的生長。