佛波酯增強肺腺癌細胞株順鉑敏感性的研究.pdf

1、目的：肺癌是我國常見的惡性腫瘤之一,它的發(fā)病率和死亡率己躍居各種惡性腫瘤的首位,目前含鉑的化療方案己被公認為是肺癌化療的一線方案。然而在臨床上,多數患者經初次化療后,甚至有部分患者在第一次化療時,肺癌細胞就對順鉑產生了耐藥性,影響了治療效果,導致化療失敗。如何逆轉腫瘤的多藥耐藥、增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性,提高化療的效果是臨床上亟待解決的問題。12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(12-O-tetradecanoylphorbol

2、-13-acetate,TPA)是佛波酯類化合物中活性較高的一種,是蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的高親和力物質。TPA通過激活PKC可以產生多種生物學效應,比如刺激或抑制細胞增殖和誘導分化、激活核轉錄因子及細胞表面受體、腫瘤促發(fā)等。已有研究表明TPA能夠促進肺癌細胞的分化而降低其惡性程度,還能增強腫瘤細胞對順鉑的敏感性,如在人宮頸癌細胞、卵巢癌細胞等,而在肺腺癌細胞尚無報道。本課題擬采用體外培養(yǎng)A549及其耐順

3、鉑細胞株A549/CP為研究對象,探討TPA能否增強肺腺癌細胞對順鉑的敏感性,并對其作用機制進一步研究,為臨床肺癌的治療尋找新的途徑和方法提供實驗基礎。
　　 方法：⑴細胞培養(yǎng)人肺腺癌細胞株A549用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃溫度,5%CO2飽和濕度的無菌培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng),每天觀察一次視情況傳代,平均每三天傳代一次。A549/CP細胞在培養(yǎng)基中加入2μg/ml的順鉑,其它培養(yǎng)條件同A549細胞。⑵TPA單用

4、及聯合順鉑對腫瘤細胞的增殖的影響采用MTT比色法檢測兩藥單用及聯合對腫瘤細胞增殖抑制的變化,繪制量效曲線,并進行統(tǒng)計學分析,評價TPA對順鉑抗腫瘤作用的影響。⑶TPA對腫瘤細胞內鉑離子濃度的影響用無焰原子吸收法檢測腫瘤細胞內鉑離子濃度的變化。⑷TPA對細胞Na+,K+-ATP酶活性及其亞基表達水平的影響分別以Na+,K+-ATP酶活性檢測試劑盒和Western Blotting法檢測TPA對兩種細胞株Na+,K+-ATP酶活性和Na+,

5、K+-ATP酶亞基表達水平的影響。
　　 結果：①TPA對細胞增殖的影響。TPA在1.6 nM和8.1 nM的濃度TPA對細胞增殖無抑制作用,而16.2nM及其以上濃度TPA對細胞有明顯增殖抑制作用,呈劑量依賴性。②TPA增強細胞對順鉑敏感性。A549細胞,藥物作用24小時CP單用組分別與1.6nM TPA聯合組、8.1nMTPA聯合組相比IC50分別下降62%和69%(P＜0.01,與CP組比較),增敏倍數分別為2.6、3.2

6、;藥物作用48小時CP單用組分別與1.6nM TPA聯合組、8.1nMTPA聯合組相比IC50分別下降67%和68%(P＜0.01,與CP組比較),增敏倍數分別為3.0、3.1;藥物作用72小時CP單用組分別與1.6nM TPA聯合組、8.1nMTPA聯合組相比IC50分別下降55%和63%(P＜0.01,與CP組比較),增敏倍數分別為2.2、2.7;藥物作用96小時CP單用組分別與1.6nM TPA聯合組、8.1nMTPA聯合組相比I

7、C50分別下降74%和77%(P＜0.01,與CP組比較),增敏倍數分別為3.8、4.4。A549/CP細胞,藥物作用24小時和48小時CP單用組分別與1.6nM TPA聯合組、8.1nM TPA聯合組相比IC50值統(tǒng)計無顯著差異;藥物作用72小時CP單用組分別與1.6nM TPA聯合組、8.1nM TPA聯合組相比IC50分別下降23%和17%(P＜0.05,與CP組比較),增敏倍數分別為1.3、1.2;藥物作用96小時CP單用組分別

8、與1.6nM TPA聯合組、8.1nM TPA聯合組相比IC50分別下降67%和69%(P＜0.01,與CP組比較),增敏倍數分別為3.0、3.2。③TPA對順鉑在胞內蓄積的影響。A549胞內鉑離子濃度隨著順鉑劑量的增加而增加呈劑量依賴性,1.6nM、8.1nM TPA處理組在10gg/ml、20μg/ml、30μg/ml順鉑作用兩小時后其胞內鉑離子濃度均增加一倍以上,顯著高于CP組(P＜0.01);TPA+哇巴因組分別同TPA各處理組

9、相比胞內鉑離子濃度下降75%以上(P＜0.01)。A549/CP胞內鉑離子濃度隨著順鉑劑量的增加而增加呈劑量依賴性,1.6nM、8.1nM TPA處理組在10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml順鉑作用兩小時后其胞內鉑離子濃度均增加一倍以上,顯著高于CP組(P＜0.01);TPA+哇巴因組分別同TPA各處理組相比胞內鉑離子濃度下降77%以上(P＜0.01)。④TPA對順鉑從細胞內流出的影響。A549、A549/CP細胞株與含30μ

10、g/ml順鉑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時后,立即更換為新鮮無順鉑培養(yǎng)基。分別考察30min、60min、120min后TPA處理組與對照組中胞內所剩余的鉑離子濃度百分比進行比較,TPA處理組與正常對照組細胞胞內鉑離子含量無統(tǒng)計學差異。⑤TPA對Na+,K+-ATP酶活性的影響。A549/CP細胞Na+,K+-ATP酶活性顯著低于A549細胞(P＜0.05),TPA能夠顯著增強A549、A549/CP細胞的Na+,K+-ATP酶活性(P＜0.05