青蒿琥酯通過影響神經(jīng)酰胺從頭合成途徑的限速酶SPT抑制肝纖維發(fā)生的作用.pdf

1、目的：
　　研究青蒿琥酯對肝星狀細胞株LX-2細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺從頭合成途徑的限速酶SPT及神經(jīng)酰胺水平的影響，揭示其促進神經(jīng)酰胺從頭合成的抑制肝纖維發(fā)生的作用機制，為青蒿琥酯應用于肝纖維化的臨床防治提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、以體外培養(yǎng)人源肝星狀細胞（HSCs）株LX-2為實驗對象，將其分為細胞對照組、青蒿琥酯（Art）給藥組、神經(jīng)酰胺C2(C2-ceramide, C2)給藥組、青蒿琥酯與神經(jīng)酰胺C2合用組。采

2、用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法分析LX-2細胞的增殖情況；應用高效液相色譜HPLC-FLD法測定LX-2細胞培養(yǎng)上清中神經(jīng)酰胺C2的水平；采用Western Blot法檢測LX-2細胞內(nèi)凋亡相關蛋白bax、bcl-2及caspase-3的表達水平；應用比色法檢測細胞上清液中乳酸脫氫酶（LDH）的活性，以分析青蒿琥酯及神經(jīng)酰胺C2對LX-2的細胞毒性；利用酶消化法檢測LX-2細胞上清液中的羥脯氨酸（Hyp）含量，評價青蒿琥酯抑制肝纖維發(fā)生的

3、作用。
　　2、將 LX-2細胞分為細胞對照組、青蒿琥酯給藥組、絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑—多球殼菌素（myriocin）給藥組、青蒿琥酯與多球殼菌素合用組。Western Blot法檢測LX-2細胞內(nèi)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1（SPTLC1）和2（SPTLC2）的表達水平，并用HPLC-FLD法檢測其上清液中神經(jīng)酰胺C2含量，對青蒿琥酯影響LX-2細胞內(nèi)的神經(jīng)酰胺從頭合成途徑加以證實；同時，分別如上述方法檢測LX-2細胞增殖，細胞內(nèi)ba

4、x、bcl-2及caspase-3蛋白表達，上清液中Hyp的含量。
　　結果：
　　1、青蒿琥酯提高了 LX-2細胞中神經(jīng)酰胺的水平及其作用：與細胞對照組比較得出，青蒿琥酯可顯著抑制LX-2的細胞增殖，且其增殖抑制作用呈濃度依賴性和時間依賴性，差異具有統(tǒng)計學意義；青蒿琥酯給藥組細胞上清中神經(jīng)酰胺含量均明顯增加（P<0.05）；同時，青蒿琥酯可上調(diào) LX-2細胞內(nèi)凋亡相關蛋白 bax與 caspase-3的表達，下調(diào) bcl-

5、2蛋白的表達，使 bax/bcl-2比值增大（P<0.05）；青蒿琥酯組LDH活性與對照組比較無顯著性差異（P>0.05）；青蒿琥酯各劑量作用于LX-2細胞24 h后，細胞上清液中Hyp的含量明顯減少，且Hyp含量隨著青蒿琥酯劑量的增大而逐漸下降（P<0.05）。C2可抑制LX-2的細胞增殖（P<0.05），且其抑制作用呈劑量依賴性；隨著 C2濃度的增加，細胞內(nèi)bax與caspase-3蛋白表達增多，bcl-2蛋白表達減少，使bax/b

6、cl-2比值增大，差異具有顯著性意義；但各組間 LDH活性的差異均無顯著性意義（P>0.05）；C2可呈劑量依賴性地顯著降低LX-2細胞上清液中的Hyp含量（P<0.05）。
　　2、青蒿琥酯增加了LX-2細胞內(nèi)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1和2的表達及其作用：與細胞對照組比較得出，15μmol/L多球殼菌素處理LX-2細胞24h時后細胞呈明顯的增殖狀態(tài)（P<0.05）；青蒿琥酯給藥組的 LX-2細胞中神經(jīng)酰胺從頭合成途徑的限速酶 SPTL

7、C1和 SPTLC2蛋白表達增多，細胞上清液中神經(jīng)酰胺含量增加，且差異均具有統(tǒng)計學意義；而 SPT特異性抑制劑多球殼菌素可減少LX-2細胞表達SPTLC1和SPTLC2蛋白（P<0.05），同時，細胞上清液中神經(jīng)酰胺的含量也降低（P<0.05）；15μmol/L多球殼菌素分別與250、350、450μmol/L青蒿琥酯合用后，可減弱青蒿琥酯對LX-2細胞的增殖抑制作用，而且降低青蒿琥酯上調(diào)SPTLC1、SPTLC2蛋白表達及神經(jīng)酰胺水平

8、的作用（P<0.05）；與青蒿琥酯單獨用藥比較，合用15μmol/L多球殼菌素后可減弱青蒿琥酯上調(diào)bax、caspase-3及下調(diào)bcl-2蛋白表達的能力，同時降低了青蒿琥酯降低LX-2上清液中羥脯氨酸的作用，差異均有統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　1、青蒿琥酯可通過增加神經(jīng)酰胺從頭合成途徑的限速酶SPT的表達，提高細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的水平。
　　2、青蒿琥酯通過提高 LX-2細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的含量，一方面呈劑量和時間依賴性地