神經(jīng)酰胺代謝酶抑制劑對其含量的影響及鞘磷脂酶在雙氧化酶1激活中的作用.pdf

1、隨著科技的發(fā)展,鞘脂從最初的被認(rèn)為僅具有形成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的功能,到現(xiàn)在被證實是具有廣泛生理活性的中介物,參與著細(xì)胞內(nèi)各種信號傳遞和轉(zhuǎn)導(dǎo)。而細(xì)胞內(nèi)鞘脂代謝的中心分子神經(jīng)酰胺,也越來越受到科學(xué)家們的關(guān)注。神經(jīng)酰胺是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使,近年來,關(guān)于神經(jīng)酰胺在各種疾病中的研究急劇增多。
　　神經(jīng)酰胺可由酸性鞘磷脂酶(ASMase)水解鞘磷脂產(chǎn)生,同時,也可被神經(jīng)酰胺酶分解為鞘氨醇、在鞘磷脂合成酶的作用下轉(zhuǎn)化生成鞘磷脂;在細(xì)胞內(nèi),神經(jīng)酰胺與

2、鞘磷脂和鞘氨醇存在動態(tài)平衡的關(guān)系,其中一種物質(zhì)的生成直接或間接影響另外兩種物質(zhì)的水平。脂筏是一種位于細(xì)胞膜上的單位體,它是一些富含膽固醇和鞘脂的微區(qū)域,像小筏一般漂浮于流動的細(xì)胞膜中,故稱之為“脂筏”。當(dāng)細(xì)胞受到某種刺激時,脂筏被鞘磷脂酶激活并釋放出大量由鞘磷脂水解而來的神經(jīng)酰胺,神經(jīng)酰胺由于氫鍵作用相互聯(lián)接形成微區(qū),微區(qū)之間又可以迅速連接,形成一個或幾個平臺區(qū)。這些富含神經(jīng)酰胺的脂筏平臺區(qū)廣泛地參與胞內(nèi)各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運。

3、>　　近期研究發(fā)現(xiàn),動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生與脂質(zhì)代謝異常特別是鞘磷脂、神經(jīng)酰胺的異常密切相關(guān),氣道炎癥如支氣管哮喘的發(fā)生也與脂筏通路的激活息息相關(guān)。基于此,本研究擬觀察,在給予神經(jīng)酰胺干擾劑后,神經(jīng)酰胺的水平是否發(fā)生變化,為下一步觀察低密度脂蛋白(LDL)和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的穿胞(transcytosis)是否隨著神經(jīng)酰胺含量的變化而發(fā)生改變奠定檢測學(xué)的基礎(chǔ)。另外,我們還通過轉(zhuǎn)染特異性siRNA進入

4、細(xì)胞,特異性抑制氣道上皮細(xì)胞中與炎性反應(yīng)密切相關(guān)的雙重氧化酶(Duox1)和與脂筏激活、神經(jīng)酰胺產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)的酸性鞘磷脂酶的蛋白表達(dá),觀察活性氧生成量的變化和核轉(zhuǎn)錄因子 NF–κB活性的改變,來觀察Duox1的活化是否依賴于脂筏-神經(jīng)酰胺通路的激活。
　　這些研究有助于我們更多地了解脂筏-神經(jīng)酰胺通路在細(xì)胞分子水平中的各種作用及機制。
　　文章從以下兩部分就神經(jīng)酰胺代謝酶抑制劑對其含量的影響及鞘磷脂酶在雙氧化酶1激活中的作用進

5、行了綜述。
　　第一部分神經(jīng)酰胺代謝酶抑制劑對其含量的影響
　　目的:觀察神經(jīng)酰胺干擾劑 Myriocin、D609、NOE和L-carnitine對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中神經(jīng)酰胺含量的影響。
　　材料和方法:1、培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,利用細(xì)胞計數(shù)試劑盒(Cell counting kit-8, CCK-8),測定不同處理組的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性;2、提取脂質(zhì),利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法(HPLC-MS/MS)檢測不同

6、處理組的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中神經(jīng)酰胺水平的變化。
　　結(jié)果:1.根據(jù) CCK-8試驗結(jié)果選擇對細(xì)胞基礎(chǔ)生理活性無明顯影響的藥物濃度Myriocin(30μmol/L)、D609(30μmol/L)和NOE(10μmol/L)、L-carnitine(5mmol/L)來進行實驗,以期各種藥物對相應(yīng)酶的活性達(dá)到最佳抑制效果而對細(xì)胞的正常生理活性無明顯影響。2、HPLC-MS/MS結(jié)果發(fā)現(xiàn),在上述藥物濃度下,神經(jīng)酰胺從頭合成抑制劑 Myr

7、iocin使細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺含量明顯減少(P<0.05);而神經(jīng)酰胺酶抑制劑 NOE和鞘磷脂合成酶抑制劑 D609均使細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺含量明顯增加(P<0.05);而酸性鞘磷脂酶抑制劑 L-carnitine使細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺含量明顯增加(P<0.05)。
　　結(jié)論:建立了細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺含量測定的高效液相色譜-質(zhì)譜測定法,研究了神經(jīng)酰胺代謝酶抑制劑對細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺含量的影響,為進一步研究神經(jīng)酰胺代謝酶抑制劑的藥理作用打下基礎(chǔ)。
　

8、　第二部分鞘磷脂酶在雙氧化酶激活中作用
　　目的:雙氧化酶Duox1是氣道上皮細(xì)胞中NADPH氧化酶(NADPH oxidase,Nox)的主要亞型,在氧分子的參與下,能夠直接催化其底物產(chǎn)生過氧化氫,引起細(xì)胞生理和病理反應(yīng)。由于脂筏來源的神經(jīng)酰胺在Nox的激活中發(fā)揮十分關(guān)鍵的作用,本實驗通過干擾脂筏-神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶,酸性鞘磷脂酶,來觀察和探討 Duox1的激活是否也依賴于脂筏來源的神經(jīng)酰胺。
　　方法:設(shè)計合成ASM酶