酸性鞘磷脂酶在化療藥物導(dǎo)致卵巢功能損傷中作用的研究.pdf

1、隨著醫(yī)療水平的提高及更早期的診斷，癌癥患者的生存期也得到相應(yīng)延長。尤其是兒童期的癌癥，預(yù)后有極大的提高，如今有>70﹪的兒童期癌癥患者有可能被治愈。在美國，每年大約有4000名青春期前女性因不同的兒童期惡性腫瘤接受化療或放療，而卵巢早衰(POF)是化療和放療伴隨產(chǎn)生的最普遍的遠(yuǎn)期后果。 因從胚胎期始女性的卵巢內(nèi)生殖細(xì)胞數(shù)目即是有限且不可再生的，卵巢功能的損傷呈漸進(jìn)性加重趨勢且不可逆轉(zhuǎn)。卵巢功能不足會造成月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)、第二性征不

2、發(fā)育或發(fā)育遲緩、不孕、早絕經(jīng)、心血管系統(tǒng)疾病以及骨質(zhì)疏松等，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量，故女性腫瘤患者放化療過程中卵巢生殖和內(nèi)分泌功能損傷成為臨床工作亟待解決的難題。 近年來關(guān)于卵巢功能的保護(hù)取得了一定進(jìn)展，目前主要方法有：冷凍卵母細(xì)胞，冷凍胚胎，贈卵及冷凍卵巢皮質(zhì)。但每一種方法均存在一定局限性，且只能解決生育問題，對于內(nèi)分泌功能缺失的彌補(bǔ)則不能實(shí)現(xiàn)。卵巢的移植則由于局部缺血-再灌注損傷等原因，遠(yuǎn)期療效不佳。而對于如何降低抗腫瘤治療所導(dǎo)

3、致的卵泡丟失，實(shí)現(xiàn)在體卵巢功能的保存，值得進(jìn)一步探索研究。 化療藥物殺傷細(xì)胞可能主要通過兩種途徑：一種為干擾正常的細(xì)胞生長增殖周期。另外一種已被廣泛接受的途徑則是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由于出生后卵母細(xì)胞停滯于減數(shù)分裂Ⅰ期，不具有有絲分裂活性，化療藥物通過介入干擾細(xì)胞增殖產(chǎn)生卵巢毒性的比例應(yīng)相對較小，即促凋亡途徑而非抗有絲分裂途徑，是化療藥物導(dǎo)致卵巢功能損傷的主導(dǎo)途徑，而近年來的研究已經(jīng)證實(shí)這一觀點(diǎn)。且越來越多的研究顯示，神經(jīng)酰胺作為細(xì)胞

4、內(nèi)信號傳導(dǎo)的第二信使，在調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞凋亡起著重要作用。 神經(jīng)酰胺可由絲氨酸與棕櫚酰輔酶A從頭合成，亦可以在鞘磷脂酶(SMase)催化下由神經(jīng)鞘磷脂的水解生成。由鞘磷脂酶催化水解生成的神經(jīng)酰胺很久以來已被證實(shí)與信號傳導(dǎo)功能相關(guān)。酸性鞘磷脂酶(acid sptlingomyelinase，ASMase)，作為SMase最重要的一個亞型，在參與信號傳導(dǎo)并調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著重要作用。 ASMase是一種可溶性糖

5、蛋白，主要分布于溶酶體。在一定的外源性刺激下，如細(xì)胞因子，離子輻射，熱休克，化療藥物，受體特異性配體作用，環(huán)境因素如壓力，缺血一再灌注等，ASMase可迅速活化，分泌釋放到細(xì)胞表面，水解細(xì)胞膜上鞘磷脂的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生神經(jīng)酰胺和磷酸膽堿。神經(jīng)酰胺可以作用于細(xì)胞凋亡過程中的多個位點(diǎn)，可通過SAPK/JNK信號傳導(dǎo)通路，亦可作用于蛋白激酶C(PKC)等，影響其下游的酶反應(yīng)，通過多種信號傳導(dǎo)通路產(chǎn)生生物作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這種鞘磷脂酶-神經(jīng)酰

6、胺途徑介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)已被證實(shí)是廣泛存在的。 2000年Motita等人使用ASMalSe表達(dá)基因(SMPDl)敲除的小鼠與野生型小鼠比較發(fā)現(xiàn)，前者具有更多的卵泡儲備，并且在體外實(shí)驗(yàn)中，SMPD1/-的小鼠卵母細(xì)胞幾乎可以完全抵抗化療藥物多柔比星(doxorubicin，DXR)所導(dǎo)致的損傷，而選擇性的神經(jīng)酰胺合成酶抑制劑煙曲霉素B1(FLlmorlisin B1)不能減少卵母細(xì)胞凋亡。而由此認(rèn)為ASMase水解膜磷脂生成神經(jīng)酰胺

7、在DXR所導(dǎo)致的卵母細(xì)胞的凋亡中起到主導(dǎo)作用。 環(huán)磷酰胺(Cyclop}lOSphamid，CTX)，與DXR同屬于非細(xì)胞周期特異性DNA損傷性化療藥物，其屬于烷化劑類，導(dǎo)致卵巢功能損傷的風(fēng)險性最高。2005年DesmelJles P的體外實(shí)驗(yàn)研究顯示在較小的始基卵泡中，CTX活性代謝物毒性作用的靶細(xì)胞主要為卵母細(xì)胞，而在較大的初級卵泡中，顆粒細(xì)胞則是主要的作用靶細(xì)胞。而使用CTX導(dǎo)致的卵泡損傷是否通過ASMase-神經(jīng)酰胺途

8、徑介導(dǎo)，目前國內(nèi)外均無相關(guān)研究。 上述研究均為體外培養(yǎng)細(xì)胞的處理，那么在在體情況下，使用化療藥物刺激后，ASMase的表達(dá)是否有改變呢?本研究以育齡期雌性BALB/C小鼠為對象，分組使用化療藥物DXR、CTX、生理鹽水處理后取卵巢組織評估比較化療后ASMase表達(dá)情況，并在化療同時使用或不使用ASMase抑制劑-去甲丙咪嗪(desipramine，DP)處理小鼠后，取卵巢組織，比較卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞的凋亡情況，以期能初步探討使

9、用這兩種藥物在體化療過程中，ASMase在卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞凋亡中的意義，為探索卵巢功能保護(hù)相關(guān)治療提供新的位點(diǎn)。 材料與方法 1.實(shí)驗(yàn)動物健康性發(fā)育成熟未交配過的SPF級雌性BALB/C小鼠，體重20-21克，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物質(zhì)量合格證號：2006A003。給予標(biāo)準(zhǔn)光照(14h光照、10h黑夜)、室內(nèi)溫度(20±2)℃、濕度40﹪～50﹪、標(biāo)準(zhǔn)飼料和水，飼養(yǎng)三周開始試驗(yàn)。飼養(yǎng)期間，觀察其體態(tài)正常，毛色健

10、康，無行為異常者方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。開始實(shí)驗(yàn)時，小鼠周齡為9-11周。 2.實(shí)驗(yàn)方法 將36只雌性BALB/C小鼠隨機(jī)分成6大組：A組為DXR組，6只，單劑量腹腔注射10mg/kgDXR；B組為DXR+去甲丙咪嗪組6只，單劑量腹腔注射10mg/kg DXR+10mg/kg去甲丙咪嗪(使用DXR前)；C組為CTX組，6只，單劑量腹腔注射75mg/kgCTX；D組為CTX+去甲丙咪嗪組，6只，單劑量腹腔注射75mg/kgCTX+1

11、0mg/kg去甲丙咪嗪(使用CTX前)；E組為去甲丙咪嗪組，6只，單劑量腹腔注射10mg/kg去甲丙咪嗪；F組為生理鹽水組，6只，單劑量腹腔注射0.1ml生理鹽水。24小時后，取雙側(cè)卵巢系列切片，其中A，C，F(xiàn)組取組織切片使用免疫組織化學(xué)法半定量檢測并比較ASMa．se的表達(dá)情況，A，B，C，D，E，F(xiàn)組均行TUNEL法檢測卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果 六組實(shí)驗(yàn)小鼠使用上述藥物處理24小時后均存活。 1.

12、卵巢組織ASMase免疫組化檢測結(jié)果．(A組，C組，F(xiàn)組)可見生理鹽水處理組小鼠卵巢各級卵母細(xì)胞及部分顆粒細(xì)胞胞漿胞膜著色，呈淡黃色。DXR及CTX組組卵母細(xì)胞胞漿及胞膜著色明顯加深，顆粒細(xì)胞表達(dá)陽性者較生理鹽水組增加，呈棕黃色，其中晚期生長卵泡及竇卵泡著色相對原始卵泡及早期生長卵泡深。統(tǒng)計結(jié)果DXR組ASMase表達(dá)高于NS組，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=2.226，P=0.026)；CTX組ASMase表達(dá)亦高于NS組，差別具有統(tǒng)計學(xué)意

13、義(Z=2.121，P=0.034)。DXR組及CTX組卵巢組織均可見間質(zhì)組織ASMase呈強(qiáng)陽性表達(dá)。 2.卵巢組織TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果：(A組，B組，C組，D組，E組，F(xiàn)組)可見卵泡中凋亡陽性細(xì)胞核可見較多的深棕色細(xì)顆粒狀物質(zhì)并且非常致密，同期所設(shè)陰性對照中胞核為蘇木素染成藍(lán)色。統(tǒng)計結(jié)果示DP組與NS組間各級卵泡細(xì)胞凋亡率均無明顯差異(P>0.05)，鑒于DP組及NS組卵母細(xì)胞凋亡數(shù)目少，未納入統(tǒng)計結(jié)果。

14、 a.DXR組小鼠原始卵泡中卵母細(xì)胞凋亡最劇(63.73﹪)，其次為初級卵泡(60.88﹪)，次級卵泡最少(46.78﹪)。各級卵泡中顆粒細(xì)胞凋亡率數(shù)值相近。DXR+DP組各級卵泡卵母細(xì)胞凋亡率及顆粒細(xì)胞凋亡率較DXR組均有下降，統(tǒng)計學(xué)分析示差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。DXR+DP組原始卵泡及初級卵泡顆粒細(xì)胞凋亡率仍較NS組，DP組偏高，差別均具有統(tǒng)計學(xué)意義。次級卵泡顆粒細(xì)胞凋亡率三組數(shù)值近似，差別無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。 b

15、.CTX組中原始卵泡及初級卵泡中卵母細(xì)胞凋亡較嚴(yán)重，凋亡率達(dá)到75.55﹪及65.16﹪，顆粒細(xì)胞凋亡則相對較輕；而在次級卵泡中卵母細(xì)胞凋亡率僅為37.48﹪，顆粒細(xì)胞凋亡率較原始卵泡及初級卵泡高。 CTX+DP組各級卵泡中卵母細(xì)胞凋亡率與CTX組相比較均有所降低，原始卵泡及初級卵泡中分析結(jié)果示有統(tǒng)計學(xué)學(xué)差異((P<0.05)，而在次級卵泡中，P>0.05，差別不具有統(tǒng)計學(xué)意義。CTX+DP組各級卵泡顆粒細(xì)胞凋亡率較CTX組均有降低，統(tǒng)

16、計結(jié)果示有統(tǒng)計學(xué)學(xué)差異((P<0.05)。CFX+DP組各級卵泡顆粒細(xì)胞凋亡率較NS組及DP組均有升高，統(tǒng)計結(jié)果示有統(tǒng)計學(xué)學(xué)差異((P<0.05)。 結(jié)論 1.化療藥物DXR，CTX可導(dǎo)致小鼠卵巢卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞凋亡。 2.使用化療藥物DXR或CTX的實(shí)驗(yàn)組，卵巢組織ASMase的表達(dá)較生理鹽水組有升高，提示該兩種藥物可使ASMase表達(dá)上調(diào)。 3.使用去甲丙咪嗪在體抑制ASMase作用后，DXR導(dǎo)致