基于干細胞的新型基因靶向傳遞系統(tǒng)的構建及在腫瘤治療中的體內(nèi)外研究.pdf

1、作為一種極具前景的新型腫瘤輔助治療手段，基因療法近年來已被證明有著極大的應用潛力，然而，如何安全、有效地將這些治療基因傳遞至腫瘤部位，以及跟蹤傳遞至轉移瘤卻是當前腫瘤基因治療領域一直面臨的一個瓶頸問題。例如，對于抗腫瘤自殺基因療法，就需要有一種載體，它既要能克服體內(nèi)的種種生理障礙將治療基因傳遞至腫瘤細胞，并促使相關功能蛋白在腫瘤區(qū)域獲得高表達，又要在抵達腫瘤細胞前能有效保護所攜載的治療基因，避免其在血液循環(huán)中被降解，這就對相應的載體系統(tǒng)

2、提出了很高的要求。
　　本課題針對這一腫瘤基因治療中的重要問題，基于靶向藥物傳遞系統(tǒng)（TargetDrug Delivery System，TDDS）的概念，提出了一種以生物活性細胞構建基因靶向傳遞系統(tǒng)的設想。研究采用非病毒基因轉染系統(tǒng)對骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)進行基因重組以攜載治療基因，進而利用BMSC的腫瘤歸巢性和免疫豁免性等特性，實現(xiàn)將治療基因靶向運輸至腫瘤細胞的目的。并通過體內(nèi)外研究全面考察了這一基于BMSC的基因靶向

3、傳遞系統(tǒng)在小鼠肺腫瘤模型中的抗腫瘤治療效果。同時，對靜脈注射的BMSC向腫瘤組織的遷移和穿透以及BMSC作為基因傳遞載體的安全性進行了探討。
　　為了使BMSC能高效攜載治療基因，本課題首先對BMSC的體外基因轉染系統(tǒng)進行了考察。通過對課題前期工作中合成的一些新型非病毒基因載體以及部分常用的商品化轉染試劑在BMSC上的基因轉染效率和細胞毒性的篩選，發(fā)現(xiàn)精胺修飾的陽離子化普魯蘭多糖(spermine-pullulan，SP)在BMS

4、C上表現(xiàn)了高效的轉染效率和較低的細胞毒性。進一步，本課題對SP的合成及轉染條件分別進行了優(yōu)化以獲得在大鼠BMSC上最佳的基因轉染效率。課題同時還對SP/pDNA復合物入胞后在細胞內(nèi)的分布和SP的降解過程進行了考察，研究了該載體在于細胞上應用的安全性。
　　隨后，本課題分別在體內(nèi)外考察了BMSC對黑色素轉移瘤細胞(B16F10)的趨向性（歸巢性），探討利用BMSC作為載體向腫瘤組織靶向傳遞治療基因的可行性。課題首先通過體外Trans

5、well實驗確認了BMSC對B16F10腫瘤細胞的趨向性。進一步在體內(nèi)通過熒光標記的方式觀察BMSC靜脈注射后在小鼠主要臟器中的分布及在荷瘤肺部的局部分布，確認了BMSC向肺部黑色素腫瘤細胞的歸巢特性。
　　為了研究構建的基于BMSC的靶向基因傳遞系統(tǒng)在腫瘤基因治療中的療效，本課題選擇了經(jīng)典的基于皰疹病毒胸苷激酶/更昔洛韋（Herpes simplex virusthymidine kinase/Ganciclovir, HSV-

6、TK/GCV）的自殺基因治療系統(tǒng)，考察了以BMSC作為HSV-TK的傳遞載體結合GCV治療后在黑色素瘤肺轉移小鼠模型上的治療效果。體外研究結果顯示，利用本課題構建的基于SP的非病毒基因轉染系統(tǒng)可以有效重組BMSC表達自殺基因HSV-TK，并引起B(yǎng)MSC的自殺，且這種自殺作用與GCV呈明顯的劑量依賴關系。體外旁觀者效應的考察發(fā)現(xiàn)重組自殺基因后的BMSC在一定GCV濃度下能有效抑制B16F10腫瘤細胞的生長。但這種旁觀者效應需要BMSC與腫

7、瘤細胞的良好接觸才能有效發(fā)揮，且對腫瘤細胞的殺傷效率與BMSC和腫瘤細胞的細胞數(shù)目比有關，BMSC所占的細胞數(shù)比例越高，相應的旁觀者效應就越強。體內(nèi)抑瘤實驗進一步證明以BMSC作為HSV-TK的靶向腫瘤的傳遞載體在GCV存在的條件下可以顯著抑制黑色素轉移瘤的發(fā)展，顯示了良好的腫瘤抑制效果。
　　進一步地，為了實現(xiàn)自殺基因和前體藥物對于荷瘤組織的同步靶向，提高這一自殺基因治療策略的抗腫瘤效果，本課題設計了一種可以將基因和前體藥物分別

8、靶向到腫瘤組織的組合傳遞系統(tǒng)。該系統(tǒng)在采用BMSC傳遞自殺基因HSV-TK靶向至腫瘤細胞的同時利用脂質(zhì)體載體系統(tǒng)將前體藥物GCV共傳遞至荷瘤肺部。通過同時提高基因在腫瘤組織的表達水平和前體藥物在腫瘤負荷臟器的局部濃度來獲得更好的抑瘤效果，并降低潛在的毒副反應。課題通過逆向蒸發(fā)法制備了具有肺被動靶向功能的GCV脂質(zhì)體，結果顯示該脂質(zhì)體靜脈注射后能顯著提高GCV在肺部的藥物濃度。體內(nèi)共靶向研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射該脂質(zhì)體后，能將攜載的藥物有效傳遞

9、至BMSC與腫瘤細胞所在的區(qū)域。體外在三維腫瘤球模型上的治療結果表明，重組自殺基因HSV-TK的BMSC結合GCV脂質(zhì)體進行治療后，能有效抑制腫瘤球體積的增大。體內(nèi)在黑色素瘤肺轉移小鼠模型上的治療結果也表明，采用該共靶向傳遞策略進行抗腫瘤治療亦顯示了更好地腫瘤殺傷效率，其對肺腫瘤結節(jié)的抑制效果是單用GCV溶液和重組自殺基因HSV-TK的BMSC的兩倍，同時小鼠的生存時間相比單用GCV溶液和重組BMSC也得到了明顯的延長。TUNEL細胞凋

10、亡染色實驗結果也顯示使用該共靶向傳遞策略進行治療后能引起更多腫瘤細胞的凋亡。
　　為了考察BMSC作為治療基因的靶向傳遞載體在趨向腫瘤組織后是否還會產(chǎn)生向腫瘤組織深層穿透的能力。本研究構建了體外三維腫瘤球模型以模擬體內(nèi)的微小癌巢結構，利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察BMSC對三維腫瘤球模型的穿透能力。結果顯示BMSC具有良好的腫瘤球穿透性。在與腫瘤球共孵育48 h后即可觀察到BMSC向腫瘤球內(nèi)部的穿透，在共孵育72h后，則可發(fā)現(xiàn)BMS

11、C已分布于腫瘤球的核心區(qū)域。而對于其他非干細胞的細胞系，如HEK293細胞，即使孵育72 h后也未觀察到其對腫瘤球的穿透。進一步地，研究采用基因重組綠色熒光蛋白的BMSC(GFP-BMSC)觀察其在體內(nèi)向腫瘤組織的穿透能力。結果發(fā)現(xiàn)，在BMSC注射后第15天，在腫瘤組織的深層可以觀察到明顯的綠色熒光信號。為了更好地示蹤BMSC向腫瘤組織的遷移和穿透，課題在前期研究的基礎上制備了乙二胺-普魯蘭多糖修飾的氧化鐵納米粒，并用該納米粒標記BMS

12、C。標記后的BMSC用普魯士藍(Prussian Blue)染色法特異性顯色。對染色后的肺部腫瘤切片的觀察證明，BMSC通過靜脈注射并被肺部截留后，會逐漸向肺部的腫瘤組織遷移并穿透入腫瘤組織深層。
　　在獲得體內(nèi)外良好的抗腫瘤效果基礎上，本課題對BMSC作為基因靶向傳遞載體對小鼠的潛在毒副作用進行了初步考察。研究結果顯示，未經(jīng)基因重組的BMSC本身并不具備致瘤性，但是在荷瘤小鼠模型上注射大量未經(jīng)基因重組的BMSC（每只小鼠注射超過

13、1×106個細胞）會一定程度地促進腫瘤生長。對經(jīng)重組自殺基因的TK-BMSC聯(lián)合GCV溶液或GCV脂質(zhì)體治療后的小鼠體重觀察結果顯示，該療法并未造成小鼠體重的急劇變化。研究還對肝和肺這兩個BMSC靜脈注射后主要的分布臟器在治療后的毒副作用進行了考察。對血液中谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)的檢測結果顯示自殺基因治療前后小鼠血液中的ALT和AST水平并未發(fā)生顯著變化。但肺和肝的組織切片顯示在治療后會有輕微的炎癥反應，但未見對正常

14、的組織結構形態(tài)造成破壞。進一步地，本課題對經(jīng)自殺基因重組的BMSC和GCV脂質(zhì)體治療后的小鼠進行了初步地短期和長期的毒副作用觀察。對肺部切片的觀察結果顯示治療后短期內(nèi)（治療結束后第2天）正常肺部細胞存在著輕微的損傷。但這種損傷是可逆的，在治療結束后的第90天肺部細胞已完全恢復至正常形態(tài)，小鼠亦未見有整體毒性反應。上述結果初步證明本課題構建的基于BMSC的自殺基因治療策略是相對安全和低毒的。
　　本課題為發(fā)展基于干細胞載體的基因靶向