Sox9介導(dǎo)BMP-2誘導(dǎo)MEFs的軟骨分化及其調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、本論文將對(duì)此進(jìn)行深入研究。 第1章BMP-2誘導(dǎo)MEFs成軟骨分化　　目的：1.建立BMP-2誘導(dǎo)MEFs軟骨分化的模型；2.建立軟骨分化的檢測(cè)評(píng)估方法。 方法: 1.將傳至5-6代的MEFs，以107／ml密度重懸，取10 μl滴入24孔板的單孔中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后，加入500 μl含不同濃度BMP-2的新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。 2.采用Alcian Blue染色檢測(cè)軟骨

2、分化程度，Westem Blot檢測(cè)II型膠原的表達(dá)水平。 結(jié)果: 1.BMP-2能夠明顯促進(jìn)MEFs的成軟骨分化，且呈劑量依賴關(guān)系，200 ng／ml時(shí)的作用最為顯著。 2.BMP-2誘導(dǎo)3d即檢測(cè)到軟骨分化，隨后5d-10d范圍內(nèi)，分化更加顯著，具有明顯時(shí)間依賴關(guān)系。 3.BMP-2上調(diào)Col2al的蛋白表達(dá)水平，并呈時(shí)間依賴關(guān)系。 結(jié)論: 1.成功建立BMP-2誘導(dǎo)MEFs軟骨分化的

3、細(xì)胞模型； 2.Alcian Blue染色能夠有效評(píng)估軟骨分化水平。 第2章Sox9在軟骨分化中的作用目的1.探討B(tài)MP-2對(duì)Sox9的調(diào)控方式； 2.明確Sox9在BMP-2誘導(dǎo)的軟骨分化中的作用。 方法: 1.采用半定量RT-PCR檢測(cè)BMP-2對(duì)Sox9轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控； 2.采用Western Blot檢測(cè)BMP-2對(duì)Sox9翻譯水平的調(diào)控； 3.使用Luciferase報(bào)告

4、系統(tǒng)檢測(cè)BMP-2對(duì)Sox9轉(zhuǎn)錄活性的影響； 4.siRNA干擾MEFs中Sox9的表達(dá)，Alcian Blue染色檢測(cè)BMP-2誘導(dǎo)MEFs的軟骨分化狀況； 5.用腺病毒過(guò)表達(dá)Sox9，Alcian Blue染色檢測(cè)BMP-2誘導(dǎo)MEFs的軟骨分化狀況。 結(jié)論: 1.在軟骨分化過(guò)程中，BMP-2上調(diào)Sox9的表達(dá)并增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性； 2.Sox9是BMP-2誘導(dǎo)MEFs軟骨分化的必要因素。

5、 第3章BMP信號(hào)通路對(duì)Sox9的調(diào)控目的1.明確BMP／Smad信號(hào)通路是否參與Sox9表達(dá)與轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控； 2.明確BMP／p38信號(hào)通路是否參與Sox9表達(dá)與轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控。 方法: 1.用重組腺病毒過(guò)表達(dá)Smad6封閉BMP／Smad途徑后，半定量RT-PCR檢測(cè)BMP-2對(duì)Sox9轉(zhuǎn)錄水平的影響，Luciferase報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)對(duì)Sox9轉(zhuǎn)錄活性的影響； 2.用p38抑制劑封閉BMP／p38途

6、徑后，半定量RT-PCR檢測(cè)BMP-2對(duì)Sox9轉(zhuǎn)錄水平的影響，Luciferase報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)BMP-2對(duì)Sox9轉(zhuǎn)錄活性的影響； 結(jié)論: 1.BMP／Smad介導(dǎo)BMP-2誘導(dǎo)的Sox9轉(zhuǎn)錄活性的上調(diào)； 2.BMP／p38介導(dǎo)BMP-2誘導(dǎo)的Sox9表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄活性的上調(diào)。 第4章BMP-2調(diào)控Sox9啟動(dòng)子的活性目的1.對(duì)Sox9核心啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行定位； 2.研究BMP-2調(diào)控Sox9啟動(dòng)

7、子活性及其分子機(jī)制。 方法: 1.采用系列缺失突變結(jié)合Luciferase報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)Sox9的核心啟動(dòng)子區(qū)域，以及BMP-2調(diào)控Sox9啟動(dòng)子活性的位點(diǎn)； 2.采用EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay)技術(shù)檢測(cè)啟動(dòng)子片段與轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞外的結(jié)合， Supershift assay檢測(cè)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子特異性； 3.使用染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromosome Imm