PDCD4介導(dǎo)飲食誘導(dǎo)肥胖的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　肥胖是引起Ⅱ型糖尿病、心血管疾病及其他疾病包括癌癥的重要因素，肥胖所引發(fā)的全身性、低水平的慢性炎癥，可以引起胰島素抵抗、高血壓、高血脂等一系列代謝綜合征，目前被認(rèn)為是肥胖相關(guān)疾病的“共同土壤”，肥胖及其引發(fā)的疾病已成為二十一世紀(jì)威脅人類健康的重要因素之一。肥胖誘發(fā)胰島素抵抗及代謝紊亂的相關(guān)機(jī)制目前并不十分明確，但越來越多的證據(jù)顯示脂肪組織炎癥在其中發(fā)揮了橋梁作用。脂肪組織炎癥主要指發(fā)生于白色脂肪組織的炎癥，表現(xiàn)為炎性細(xì)

2、胞如巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞的浸潤(rùn)和活化以及促炎因子TNF-α、IL-6等的表達(dá)升高，可以誘發(fā)肝臟、脂肪等組織的胰島素抵抗，進(jìn)而導(dǎo)致代謝紊亂和肥胖相關(guān)疾病的發(fā)生。因此，肥胖及其相關(guān)炎癥的控制是預(yù)防和治療肥胖相關(guān)疾病的重要措施。
　　程序性細(xì)胞死亡因子4(Programmed cell death4，PDCD4)，是一種最初發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞凋亡的基因，它普遍表達(dá)于正常組織，在肝中表達(dá)最高。PDCD4主要通過影響轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，近年發(fā)現(xiàn)PD

3、CD4參與一些炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展，研究表明PDCD4缺失不僅抵抗實(shí)驗(yàn)性腦脊髓膜炎和Ⅰ型糖尿病的發(fā)生，還可以負(fù)向調(diào)控脂多糖誘導(dǎo)的致死性炎癥，提示PDCD4具有促炎作用。然而PDCD4是否參與肥胖及相關(guān)炎癥的發(fā)生，目前尚無研究涉及。
　　肝X受體(Liver X receptor,LXR)-α，是核受體家族的成員，它廣泛分布于多種組織中，并且發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。LXR-α可以通過上調(diào)三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP-binding ca

4、ssette transporter,ABC)A1和G1的表達(dá)促進(jìn)膽固醇由外周組織向肝臟的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，也可直接或間接調(diào)控其他脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)揮平衡脂質(zhì)的作用。
　　為了明確PDCD4對(duì)飲食誘導(dǎo)肥胖的影響及其機(jī)制，本課題分別對(duì)PDCD4敲基因(PDCD4-/-)小鼠和野生型（wildtype，WT）小鼠進(jìn)行高脂飲食喂養(yǎng)，并對(duì)其肥胖程度、脂肪組織炎癥、肝臟脂肪變等情況進(jìn)行研究，并進(jìn)一步通過相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了探討，證明了

5、PDCD4參與介導(dǎo)飲食誘導(dǎo)的肥胖、脂肪組織炎癥及脂肪肝的發(fā)生，并明確了PDCD4通過結(jié)合并影響LXR-αmRNA的翻譯而發(fā)揮作用。
　　方法：
　　1.PDCD4對(duì)飲食誘導(dǎo)肥胖的影響
　　1.1飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠模型的建立
　　雄性PDCD4-/-和WTC57BL/6小鼠在8周齡時(shí)給予高脂飼料喂養(yǎng)24周，以建立飲食誘導(dǎo)肥胖模型。每組3-5只，同時(shí)設(shè)立常規(guī)飼料喂養(yǎng)對(duì)照組小鼠。
　　1.2PDCD4基因缺失對(duì)高脂

6、小鼠肥胖的影響
　　每隔1周對(duì)高脂及常規(guī)喂養(yǎng)小鼠進(jìn)行稱重，同時(shí)監(jiān)測(cè)飲食量的變化。高脂飲食喂養(yǎng)至24周時(shí)，處死小鼠取其附睪周圍白色脂肪組織進(jìn)行稱重。對(duì)白色脂肪組織切片進(jìn)行HE染色，觀察細(xì)胞形態(tài)，比較細(xì)胞大小。
　　1.3PDCD4基因缺失對(duì)高脂小鼠白色脂肪組織炎癥的影響
　　取高脂及常規(guī)喂養(yǎng)24周的小鼠白色脂肪組織切片進(jìn)行CD68染色，觀察巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況。RT-PCR法檢測(cè)并比較炎性因子TNF-α和IL-6的表達(dá)。

7、r>　　1.4PDCD4基因缺失對(duì)高脂小鼠肝臟脂肪變的影響
　　取高脂及常規(guī)喂養(yǎng)24周的小鼠肝臟進(jìn)行稱重;并對(duì)肝臟切片進(jìn)行HE染色，觀察肝細(xì)胞脂肪變情況;抽提并比較肝臟中的甘油三酯含量。
　　2.PDCD4影響飲食誘導(dǎo)肥胖的機(jī)制研究
　　2.1能量消耗的檢測(cè)
　　高脂飲食喂養(yǎng)至20周時(shí)，將小鼠放入代謝籠48h，根據(jù)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)得到的數(shù)據(jù)作出統(tǒng)計(jì)圖比較能量消耗情況。
　　2.2LXR-α表達(dá)的檢測(cè)
　　2.

8、2.1棕色脂肪組織中LXR-α的表達(dá)
　　取高脂及常規(guī)喂養(yǎng)24周的小鼠棕色脂肪組織，Real-timePCR和Western-blot法檢測(cè)LXR-α以及相關(guān)基因PGC-1α和UCP1的表達(dá)。
　　2.2.2白色脂肪組織中LXR-α的表達(dá)
　　取高脂及常規(guī)喂養(yǎng)24周的小鼠白色脂肪組織，Real-timePCR和Western-blot法檢測(cè)LXR-α及其下游靶基因SREBP-1c、FAS、SCD1、ABCA1和ABCG

9、1的表達(dá)。
　　2.2.3肝臟中LXR-α的表達(dá)
　　取高脂和常規(guī)喂養(yǎng)24周的小鼠肝臟，Real-timePCR和Western-blot法檢測(cè)LXR-α的表達(dá)。
　　2.2.4ox-LDL刺激骨髓來源的巨噬細(xì)胞檢測(cè)LXR-α的表達(dá)
　　取常規(guī)喂養(yǎng)的PDCD4-/-和WT小鼠的巨噬細(xì)胞，ox-LDL(50μg/ml)刺激不同時(shí)間段，收集細(xì)胞用Western-blot法檢測(cè)LXR-α的表達(dá)，油紅O染色明確巨噬細(xì)胞中

10、油脂的變化。
　　2.3干擾實(shí)驗(yàn)明確LXR-α的功能
　　2.3.1LXR-αsiRNA干擾PDCD4-/-小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞
　　取常規(guī)飼料喂養(yǎng)的PDCD4-/-小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞，利用GenePORTER2轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染LXR-αsiRNA，同時(shí)轉(zhuǎn)染無關(guān)對(duì)照siRNA。對(duì)干擾48h的細(xì)胞用ox-LDL（50μg/ml）刺激24h，油紅O染色明確巨噬細(xì)胞中油脂的變化。
　　2.4RIP實(shí)驗(yàn)明確PDCD4是否結(jié)合L

11、XR-α的mRNA
　　取常規(guī)飼料喂養(yǎng)的WT小鼠巨噬細(xì)胞，ox-LDL（50μg/ml）刺激24h，收集巨噬細(xì)胞進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1.PDCD4基因缺失抑制飲食誘導(dǎo)的肥胖
　　1.1PDCD4基因缺失抑制高脂小鼠體重的增加
　　體重及飲食量監(jiān)測(cè)表明，高脂飲食喂養(yǎng)24周的PDCD4-/-小鼠體重明顯輕于高脂飲食喂養(yǎng)24周的WT小鼠，而常規(guī)飲食組差異不大。四組小鼠飲食攝取量無明顯差異。提示PDC

12、D4基因缺失抑制高脂小鼠體重的增加。
　　1.2PDCD4基因缺失抑制高脂小鼠白色脂肪組織的增多
　　高脂飲食喂養(yǎng)24周的PDCD4-/-小鼠白色脂肪組織重量明顯輕于高脂飲食喂養(yǎng)24周的WT小鼠，而常規(guī)飲食組差異不大。小鼠脂肪組織切片的HE染色發(fā)現(xiàn)高脂飲食喂養(yǎng)24周的PDCD4-/-小鼠白色脂肪組織細(xì)胞大小明顯小于高脂飲食喂養(yǎng)24周的WT小鼠，而常規(guī)飲食喂養(yǎng)組差異不大。提示PDCD4基因缺失抑制高脂小鼠白色脂肪組織的增多。<

13、br>　　1.3PDCD4基因缺失抑制高脂小鼠的白色脂肪組織炎癥
　　高脂飲食喂養(yǎng)24周的PDCD4-/-小鼠白色脂肪組織石蠟切片中CD68表達(dá)少于高脂飲食喂養(yǎng)24周的WT小鼠，而常規(guī)飲食組差異不大。高脂飲食喂養(yǎng)24周的PDCD4-/-小鼠白色脂肪組織中炎性因子TNF-α和IL-6的表達(dá)低于高脂飲食喂養(yǎng)24周的WT小鼠。提示PDCD4基因缺失抑制高脂小鼠的白色脂肪組織炎癥。
　　1.4PDCD4基因缺失抑制高脂小鼠脂肪肝的形

14、成
　　高脂飲食喂養(yǎng)24周的PDCD4-/-小鼠肝臟重量明顯輕于高脂飲食喂養(yǎng)24周的WT小鼠，而常規(guī)飲食喂養(yǎng)組差異不大。小鼠肝臟切片的HE染色發(fā)現(xiàn)高脂飲食喂養(yǎng)的WT小鼠肝細(xì)胞呈現(xiàn)空泡化，高脂飲食喂養(yǎng)的PDCD4-/-小鼠脂肪肝現(xiàn)象減輕，而常規(guī)飲食喂養(yǎng)組差異不大。同時(shí)，高脂飲食喂養(yǎng)的PDCD4-/-小鼠中甘油三酯含量亦明顯低于高脂飲食喂養(yǎng)的WT小鼠。提示PDCD4基因缺失抑制高脂小鼠脂肪肝的形成。
　　2.PDCD4介導(dǎo)飲食誘

15、導(dǎo)肥胖的機(jī)制研究
　　2.1PDCD4基因缺失增加能量的消耗
　　高脂飲食喂養(yǎng)20周的PDCD4-/-小鼠比高脂飲食喂養(yǎng)20周的WT小鼠能量消耗明顯增多，而常規(guī)飲食喂養(yǎng)組差異不大。提示PDCD4基因缺失增加高脂小鼠的能量消耗。
　　2.2PDCD4基因缺失促進(jìn)LXR-α的表達(dá)
　　2.2.1PDCD4基因缺失促進(jìn)高脂小鼠棕色脂肪組織中LXR-α的表達(dá)
　　高脂飲食喂養(yǎng)24周的PDCD4-/-小鼠棕色脂肪組織

16、中LXR-α的表達(dá)高于WT小鼠，同時(shí)PGC-1α的mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于WT高脂小鼠。但兩組小鼠UCP1的表達(dá)沒有明顯差異。提示PDCD4基因缺失促進(jìn)高脂小鼠棕色脂肪組織中LXR-α以及能量消耗相關(guān)基因PGC-1α的表達(dá)。
　　2.2.2PDCD4基因缺失促進(jìn)高脂小鼠白色脂肪組織中LXR-α及其下游靶基因的表達(dá)
　　高脂飲食喂養(yǎng)24周的PDCD4-/-小鼠白色脂肪組織中LXR-α及其下游靶基因SREBP-1c、FAS、

17、SCD1、ABCA1和ABCG1的表達(dá)高于WT小鼠，而常規(guī)飲食喂養(yǎng)組差異不大。提示PDCD4基因缺失促進(jìn)高脂小鼠白色脂肪組織中LXR-α及其下游靶基因的表達(dá)。
　　2.2.3PDCD4基因缺失促進(jìn)高脂小鼠肝臟中LXR-α的表達(dá)
　　高脂飲食喂養(yǎng)24周的PDCD4-/-小鼠肝臟中LXR-α表達(dá)高于WT小鼠，而常規(guī)飲食喂養(yǎng)組差異不大。提示PDCD4基因缺失促進(jìn)高脂小鼠肝臟中LXR-α的表達(dá)。
　　2.2.4PDCD4基因缺

18、失促進(jìn)骨髓來源巨噬細(xì)胞中LXR-α的表達(dá)
　　ox-LDL分別刺激來自常規(guī)飲食PDCD4-/-和WT小鼠的巨噬細(xì)胞12h和24h，同時(shí)設(shè)置未刺激對(duì)照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDCD4-/-小鼠中LXR-α的表達(dá)隨著刺激時(shí)間的增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，而WT小鼠中其變化不明顯。提示PDCD4基因缺失促進(jìn)ox-LDL刺激的巨噬細(xì)胞中LXR-α的表達(dá)。
　　2.3LXR-α抑制油脂的累積
　　ox-LDL刺激常規(guī)飲食PDCD4-/-和WT小鼠的巨

19、噬細(xì)胞24h，PDCD4-/-小鼠巨噬細(xì)胞中油脂的含量明顯低于WT小鼠。
　　LXR-αsiRNA可有效干擾來自常規(guī)飲食PDCD4-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中LXR-α的表達(dá)。ox-LDL刺激巨噬細(xì)胞24h，轉(zhuǎn)染LXR-αsiRNA組油脂含量顯著高于轉(zhuǎn)染無關(guān)對(duì)照siRNA組。提示LXR-α參與抑制PDCD4-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的油脂累積。
　　2.4PDCD4通過結(jié)合LXR-α的mRNA抑制其表達(dá)
　　ox-LDL刺激

20、來自常規(guī)飲食WT小鼠的巨噬細(xì)胞24h，收集細(xì)胞后進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)，Real-timePCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDCD4抗體組中LXR-α的mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照抗體組，提示PDCD4可以結(jié)合LXR-α的mRNA。
　　結(jié)論：
　　1.PDCD4基因缺失抑制高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖。
　　2.PDCD4基因缺失緩解高脂小鼠的白色脂肪組織炎癥。
　　3.PDCD4基因缺失緩解高脂小鼠的脂肪肝病變。
　　4.PDCD4通