奶牛乳腺CCL5轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制解析及其功能性分子標(biāo)記鑒定.pdf

1、近年來，乳腺炎的發(fā)病率依然很高，且很難治愈，給中國奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)病原體侵入乳腺可引發(fā)機(jī)體啟動系列免疫和炎癥變化，通過復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控響應(yīng)炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室前期通過RNA-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)CCL5基因在乳腺炎乳腺組織的表達(dá)量顯著高于在健康乳腺組織中的表達(dá)量(P＜0.05)。已有研究表明CCL5基因與免疫相關(guān)。鑒于此，本研究將CCL5作為乳腺抗性相關(guān)的候選基因，分別從啟動子、可變剪接和microRNA角度探討其差異表達(dá)的轉(zhuǎn)

2、錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平上的分子調(diào)控機(jī)制。同時，鑒定與乳房炎抗性相關(guān)的功能性單核苷酸多態(tài)(SNP)標(biāo)記。主要研究結(jié)果分述如下:
　　1.CCL5基因可變剪切體及功能性SNPs的鑒定
　　可變剪切是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)組多樣性的重要機(jī)制。在奶牛乳腺組織中檢測到CCL5基因的一個可變剪切體（CCL5-AS）。通過DNA sanger測序鑒定了CCL5基因CDS區(qū)的兩個SNP（g.1647C＞T和g.1804G＞A），但細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)

3、發(fā)現(xiàn)它們不會導(dǎo)致產(chǎn)生可變剪切，其具體調(diào)控機(jī)制需進(jìn)一步研究。
　　2.CCL5基因啟動子活性分析及功能性SNPs的鑒定
　　啟動子是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的重要組件。通過Genomatix軟件預(yù)測CCL5基因的啟動子區(qū)域位于（g.-1300bp～g.+172bp），在CCL5基因啟動子區(qū)鑒定了一個SNP（g.-727T＞A），雙熒光素酶報告基因活性檢測表明突變型(TT)的啟動子活性顯著高于野生型(AA)(P＜0.05)。在中國荷斯坦奶牛

4、群體中對該SNP位點(diǎn)的基因型與體細(xì)胞評分(SCS)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)TT個體的SCS值顯著高于AA個體值(P＜0.05)。
　　3.影響bta-miR-2295與靶標(biāo)CCL5靶結(jié)合能力的功能性SNPs的鑒定
　　MicroRNA能夠通過與其靶基因3'UTR結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)。通過RNA22和RNAhybrid軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)bta-miR-2295可以與CCL5基因3'UTR結(jié)合。在CCL5基因3'UTR發(fā)現(xiàn)一個SNP(g.

5、7413G＞A)。將野生型(GG)和突變型(AA)的3'UTR片段連接到pMIR報告載體中，與bta-miR-2295表達(dá)載體pEZX共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過雙熒光素酶活性分析，發(fā)現(xiàn)bta-miR-2295可使熒光素酶報告基因表達(dá)量顯著降低，這說明bta-miR-2295可與CCL5基因的3'UTR結(jié)合抑制基因表達(dá)。在中國荷斯坦奶牛群體中對該SNP位點(diǎn)的基因型與體細(xì)胞評分(SCS)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)GG個體的SCS值顯著高于AA個體的SCS值(