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文檔簡介
1、DREB(dehydration resistance element binding protein)類轉(zhuǎn)錄因子是一類與抗逆相關的轉(zhuǎn)錄因子基因,廣泛存在于各種植物中,參與調(diào)控各種與抗逆相關的功能基因的表達,在逆境脅迫應答反應過程中發(fā)揮非常重要作用。但是,目前對DREB基因的研究主要集中在功能分析方面,對其轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機制了解比較少。
本實驗室前期已經(jīng)從大豆中克隆到新的GmDREB3基因,功能研究表明,過表達GmDREB
2、3基因可以顯著提高植物的抗逆性。將GmDREB3啟動子分段缺失融合GUS報告基因采用基因槍轉(zhuǎn)化小麥成熟胚愈傷組織,利用瞬時表達的方法檢測不同長度啟動子的活性的方法,對GmDREB3啟動子進行初步分析證明,在啟動子的-705~-1117bp區(qū)域存在著低溫和干旱響應的正調(diào)控元件,在-1117~-1464bp區(qū)域存在著對低溫和干旱響應的負調(diào)控元件。在此基礎上,進一步對這兩個重要區(qū)域進行了細致分析,結(jié)果證明在-705~-731bp區(qū)域存在著對低
3、溫和干旱響應的正調(diào)控MYB元件;-1117~-1269 bp區(qū)域存在著對低溫和干旱響應起重要作用負調(diào)控MYC元件。本研究中我們利用確定的重要調(diào)控元件分別構(gòu)建了誘餌載體,采用酵母單雜交技術,分別篩選與重要調(diào)控元件結(jié)合的上游調(diào)控蛋白:運用MYC元件做誘餌篩選到了GmERF蛋白,運用MYB元件作誘餌篩選到了GmMYB蛋白。我們分別采用酵母單雜交技術和凝膠遷移率實驗驗證了MYC元件與ERF元件可以和GmERF蛋白結(jié)合,MYB元件可以和GmMYB
4、蛋白結(jié)合;通過酵母轉(zhuǎn)化驗證GmMYB蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性,而GmERF蛋白不具有轉(zhuǎn)錄激活活性。通過RT-PCR對低溫處理不同時間的擬南芥中的GmERF和GmMYB基因的表達特性進行了分析,發(fā)現(xiàn)相對表達量GmMYB呈下降趨勢,GmERF呈上升趨勢,一段時間后兩者的表達量趨于穩(wěn)定;通過酵母體內(nèi)的兩個蛋白之間的競爭性結(jié)合實驗證明在GmMYB蛋白和GmERF蛋白表達量一致的情況下,GmERF蛋白先與GmDREB3啟動子結(jié)合。為了確定GmERF和
5、GmMYB基因的功能,我們分別構(gòu)建了侵染植物的表達載體,結(jié)果分析表明,轉(zhuǎn)GmMYB基因的擬南芥能明顯提高植株的對干旱、NaCl等逆境脅迫的能力,轉(zhuǎn)GmERF基因的擬南芥對干旱、鹽等的脅迫呈現(xiàn)敏感的趨勢。綜上所述,在大豆低溫處理3h內(nèi),GmMYB蛋白與MYB元件結(jié)合,激活DREB3基因的表達,從而激活下游抗逆基因的表達;在低溫處理24h后,GmERF蛋白與MYC和ERF元件結(jié)合,抑制DREB3基因的表達,從而抑制下游抗逆基因的表達。正是由
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