八棱海棠和水稻抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的克隆及功能鑒定.pdf

1、干旱、高鹽和極端溫度非生物脅迫,嚴(yán)重影響了植物的生長和作物的產(chǎn)量.因此,系統(tǒng)研究植物對環(huán)境脅迫應(yīng)答的機(jī)制就顯得尤為重要。植物在感受環(huán)境脅迫信號后,會激活相應(yīng)的信號傳導(dǎo)途徑,誘導(dǎo)大量脅迫應(yīng)答基因表達(dá),產(chǎn)生相應(yīng)的脅迫應(yīng)答反應(yīng),在這一系列的應(yīng)答反應(yīng)過程中,轉(zhuǎn)錄因子起著十分關(guān)鍵的作用。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)以及DNA結(jié)合活性等特點,將其分成若干個家族,如AP2/EREBP、Myb、HSF、bZIP等,這些轉(zhuǎn)錄因子在脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用。本研

2、究從八棱海棠和水稻中共克隆了5個轉(zhuǎn)錄因子的基因,它們分別屬于AP2/EREBP和HSF類轉(zhuǎn)錄因子基因家族,并對它們進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和功能鑒定。 利用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技術(shù)從八棱海棠cDNA文庫中克隆到1個新的編碼AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子的全長cDNA序列,命名為MrDBP1。MrDBP1基因的開放閱讀框(ORF)由483bp組成,編碼1個由160個氨基酸組成的DR

3、EB類轉(zhuǎn)錄因子。構(gòu)建的同源進(jìn)化樹表明,MrDBP1在進(jìn)化關(guān)系上與DREB亞族轉(zhuǎn)錄因子較ERF類轉(zhuǎn)錄因子更近,屬于DREB家族的A5亞群。Southern雜交的結(jié)果表明MrDBP1基因在八棱海棠基因組中很可能以多拷貝的形式存在,或者存在兩個與MrDBP1基因同源性很高的同源基因。對MrDBP1蛋白的亞細(xì)胞定位分析表明,轉(zhuǎn)錄因子MrDBP1具有明顯的核定位能力.使用實時熒光定量PCR對MrDBP1基因在不同組織中以及不同逆境脅迫下相對的轉(zhuǎn)錄

4、水平進(jìn)行了定量分析。結(jié)果表明,MrDBP1基因的表達(dá)在種子中最高,并且受干旱的誘導(dǎo),而與低溫和高鹽的關(guān)系不大。 利用酵母單雜交方法從水稻cDNA文庫中分離了1個AP2/EREBP類和3個HSF類轉(zhuǎn)錄因子。這些基因的序列分析表明,這個AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子屬于DREB家族的A1亞群,命名為RCBF2。而這3個HSF類轉(zhuǎn)錄因子中,OsHSF6和OsHSF7屬于熱休克轉(zhuǎn)錄因子的A類亞群,而OsHSF12屬于C類亞群。對這些基因進(jìn)

5、行表達(dá)譜分析,結(jié)果表明低溫,干旱和高鹽都能夠誘導(dǎo)RCBF2基因的表達(dá),并且Ca2+和MeJA也能夠輕微誘導(dǎo)RCBF2基因的表達(dá)。此外,OsHSF6和OsHSF7對高溫應(yīng)答模式十分相似,即高溫處理十分鐘內(nèi)其mRNA的水平均達(dá)到了最高,隨后逐漸降低。為了進(jìn)一步分析OsHSF7的功能,我們通過蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥,獲得了過量表達(dá)OsHSF7基因的擬南芥植株。對轉(zhuǎn)基因植株的分析表明,OsHSF7基因的表達(dá)導(dǎo)致了擬南芥植株抗高溫能力的增強(qiáng),這主要是由

6、于在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株內(nèi)OsHSF7促進(jìn)了下游HSP,GolS等基因的過量表達(dá)。最后,我們分析了八棱海棠,水稻和擬南芥中DREB1B/CBF1同源基因,即八棱海棠的MrCBF1,水稻的OsDREB1A和擬南芥的AtCBF1功能上的差異。結(jié)果表明,這3個基因功能上存在著很大的相似性,但是,也存在著很大的差異。即表型上的差異和誘導(dǎo)下游抗性基因表達(dá)強(qiáng)度的差異。三類轉(zhuǎn)基因植株分別均表現(xiàn)出不同程度的生長滯后,D35S::MrCBF1植株在長日照條件