轉(zhuǎn)錄因子Snail家族在EMT中對(duì)CD147轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是世界常見惡性腫瘤，每年造662000人死亡，其中80％是在發(fā)展中國(guó)家。其病情進(jìn)展快、惡性程度高、治療難度大、療效差，5年生存率低于10％。
　　CD147分子屬于免疫球蛋白超家族，是高度糖基化的跨膜蛋白。CD147在腫瘤細(xì)胞膜上呈現(xiàn)高表達(dá)的狀態(tài)，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活密切相關(guān)。CD147通過(guò)誘導(dǎo)鄰近成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixme

2、talloproteinase，MMP）促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。CD147是廣泛癌標(biāo)志物，與肝癌等多種腫瘤的診斷和預(yù)后相關(guān)。
　　上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）是腫瘤進(jìn)程中的重要現(xiàn)象。在此過(guò)程中，固定于基底膜的極化上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂羞\(yùn)動(dòng)能力的間質(zhì)樣細(xì)胞，并伴隨著侵襲能力的增強(qiáng)，具有贅生細(xì)胞的特點(diǎn)。同時(shí)上皮標(biāo)志物E-鈣粘素、α-連環(huán)蛋白和γ-連環(huán)蛋白下調(diào)，間充質(zhì)標(biāo)志物N-

3、鈣粘素、波形蛋白、纖維結(jié)合蛋白上調(diào)。在多種EMT誘導(dǎo)因子中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforminggrowthfactor-，TGF-β）常表達(dá)于慢性肝病的微環(huán)境中，作為一種重要的細(xì)胞因子發(fā)揮作用。TGF-β通過(guò)經(jīng)典的Smads依賴通路和Smads非依賴通路引起EMT發(fā)生并維持細(xì)胞的間質(zhì)特性。Smads非依賴通路包含Ras、p38MAPK、PI3K/Akt通路等。盡管有這些證據(jù)，TGF-β在肝癌發(fā)生中的作用及參與EMT的具體分子機(jī)制

4、依然不明。
　　轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是真核生物基因表達(dá)調(diào)控中最重要的環(huán)節(jié)，轉(zhuǎn)錄起始階段只有轉(zhuǎn)錄因子的特異性結(jié)合才能有效起始轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子Snail家族成員在EMT中處于中心地位。Snail家族成員包含Snail1和Snail2（也稱為Slug）。Snail家族的轉(zhuǎn)錄因子具有鋅指結(jié)構(gòu)，包含4-6個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的高度保守的羧基末端和多變的氨基末端區(qū)域。Snail蛋白中心區(qū)域是絲氨酸-脯氨酸富含區(qū)域，在Snail家族成員間不同，Snail1的核輸

5、出信號(hào)（nuclearexportsignal，NES）結(jié)構(gòu)域控制著Snail1的出核，Snail2包含Slug結(jié)構(gòu)域。Snail家族成員可與靶基因上含有CANNTG的核心堿基序列的E-box作用元件結(jié)合，從而調(diào)節(jié)其下游基因的表達(dá)。
　　我們通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TGF-β1誘導(dǎo)CD147表達(dá)并參與EMT發(fā)生，但是TGF-β1如何調(diào)節(jié)CD147的表達(dá)并未被揭示，本研究旨在從轉(zhuǎn)錄因子的角度深入探討CD147表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。
　　本

6、論文的研究目標(biāo)為：首先確定CD147上是否存在轉(zhuǎn)錄因子Snail家族成員的結(jié)合位點(diǎn)；其次分析影響轉(zhuǎn)錄因子家族成員表達(dá)是否影響CD147表達(dá)；最后，通過(guò)檢測(cè)肝癌樣本中轉(zhuǎn)錄因子與CD147表達(dá)，對(duì)其相關(guān)性進(jìn)行進(jìn)一步確定。
　　第一部分：TGF-β1調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Snail家族成員與CD147的上調(diào)表達(dá)
　　通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)，在正常肝細(xì)胞QZG中給予TGF-β1刺激，Snail1和Slug表達(dá)上調(diào)，同時(shí)CD147上調(diào)表達(dá)。si

7、RNA干涉Snail1表達(dá)，可以抑制TGF-β1引起的Snail1和CD147表達(dá)上調(diào)，卻并沒有直接影響CD147表達(dá)。siRNA干涉Slug表達(dá)，可以直接下調(diào)CD147表達(dá)。在mRNA水平下調(diào)Snail1的表達(dá)，則影響Slug的表達(dá)，說(shuō)明Snail1位于Slug的上游。Westernblot在蛋白水平上也驗(yàn)證了下調(diào)Slug在一定程度上影響CD147表達(dá)。
　　第二部分：轉(zhuǎn)錄因子Slug對(duì)CD147分子的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用
　

8、　首先我們構(gòu)建Snail1和Slug的表達(dá)載體，與含CD147啟動(dòng)子上游1761bp全長(zhǎng)的熒光素酶載體共轉(zhuǎn)入細(xì)胞，從而確定Snail1和Slug是否對(duì)CD147的表達(dá)具有直接調(diào)控作用。熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，將Snail1與含CD147啟動(dòng)子上游1761bp全長(zhǎng)的熒光素酶載體共轉(zhuǎn)入細(xì)胞，Snail1不能引起熒光素酶報(bào)告基因活性的上升，而Slug可以引起熒光素酶報(bào)告基因活性的上升，表明Slug調(diào)控CD147的表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論，我

9、們將Snail1的表達(dá)載體與CD147上游1761bp、644bp、338bp的熒光素酶分段載體共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，Snail1不能引起熒光素酶報(bào)告基因活性的上升；而位于CD147啟動(dòng)子上游-563到-558區(qū)域的E-box2，對(duì)于Slug調(diào)控CD147表達(dá)是必須的。我們進(jìn)一步將E-box2CAGGTG突變?yōu)锳AGGTA，突變后的E-box2不能引起CD147啟動(dòng)子區(qū)熒光素酶報(bào)告基因活性的上升。最后通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀（chro

10、matinimmunoprecipitation，ChIP）證實(shí)，轉(zhuǎn)錄因子Slug直接調(diào)控CD147表達(dá)。
　　第三部分：轉(zhuǎn)錄因子Slug和CD147分子在肝癌樣本中的表達(dá)相關(guān)性分析
　　我們通過(guò)免疫組化的方法檢測(cè)了肝血管瘤旁肝組織、肝炎組織、肝硬化組織及肝癌組織中的CD147表達(dá)情況。所有25例肝血管瘤旁肝組織和12例肝炎組織中，CD147均為陰性；24例肝硬化組織中均為陽(yáng)性；49例高、中、低分化肝癌組織中有37例為陽(yáng)性（