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文檔簡介
1、乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,乳腺癌的轉(zhuǎn)移是影響患者療效和預(yù)后并導(dǎo)致死亡的重要因素。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個多步驟的復(fù)雜的、有序的過程,具有器官選擇性的。與造血干細(xì)胞及淋巴細(xì)胞“歸巢”類似,趨化因子在腫瘤嗜器官轉(zhuǎn)移中起了重要作用。研究表明在乳腺癌高轉(zhuǎn)移的器官組織中異常高表達(dá)CCL5,而乳腺癌組織高表達(dá)CCL5的受體CCR5,且與乳腺癌的惡性程度和病程相關(guān),由此推測CCL5 通過與乳腺癌細(xì)胞上相應(yīng)的受體CCR5 相結(jié)合而促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移。
2、Ezrin 為膜-細(xì)胞骨架連接蛋白,是ERM(Ezrin-radixin-moesin,merlin)家族成員之一,在多種惡性腫瘤中,Ezrin 高表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān),其通過改變腫瘤細(xì)胞運動、調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附、參與腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)理吞噬細(xì)胞的吞噬功能等方面,影響惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移。本課題將研究趨化因子CCL5 及其受體CCR5介導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的趨化與侵襲,并分析Ezrin 蛋白在此過程中的重要作用及
3、其機制。
方法:
1.選取人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7作為研究材料,趨化小室檢測不同濃度(0.1~100ng/ml)CCL5的作用下MCF-7細(xì)胞的侵襲活性;Western blot檢測MCF-7細(xì)胞中總的Ezrin 蛋白及磷酸化的Ezrin 蛋白表達(dá)隨CCL5 趨化時間的變化;RT-PCR法測定MCF-7細(xì)胞中趨化因子CCL5 受體CCR5的表達(dá)。
2.采用小干擾RNA方法下調(diào)Ezrin的表達(dá),分
4、別通過RT-PCR法和Western blot檢測siRNA對Ezrin mRNA和蛋白表達(dá)水平的下調(diào)。干擾后,再采用趨化小室檢測不同濃度CCL5的作用下MCF-7細(xì)胞的侵襲活性;Western blot檢測MCF-7細(xì)胞中總的Ezrin 蛋白及磷酸化的Ezrin 蛋白表達(dá)隨CCL5 趨化時間的變化。
結(jié)果:
1.不同濃度CCL5 促進(jìn)MCF-7細(xì)胞侵襲能力不同,在20ng/ml CCL5作用下,MCF-7細(xì)
5、胞表現(xiàn)出侵襲活性最強,濃度過高或過低均會影響侵襲活性;在20ng/mlCCL5作用下,總的Ezrin 蛋白及磷酸化的Ezrin 蛋白的表達(dá)隨侵襲時間的延長而明顯增加;人乳腺癌細(xì)胞MCF-7表達(dá)CCL5的受體CCR5 mRNA。
2.成功構(gòu)建Ezrin特異的RNA干擾質(zhì)粒載體,與MCF-7細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒pSUPER細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染pSUPER-Ezrin表達(dá)載體的MCF-7細(xì)胞Ezrin mRNA和蛋白的表達(dá)明顯降低。干擾
6、后,在50ng/ml CCL5作用下,MCF-7細(xì)胞表現(xiàn)出侵襲活性最強,但侵襲能力均較干擾前及對照組明顯下降。在20ng/ml CCL5作用下,總的Ezrin蛋白及磷酸化的Ezrin 蛋白的表達(dá)隨侵襲時間的延長而增加微量。
結(jié)論:趨化因子CCL5 促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的趨化與侵襲,Ezrin 蛋白的激活在此過程中起著重要的作用;成功構(gòu)建Ezrin特異性siRNA表達(dá)載體,可用于探討乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移機制,并為有效地抑制
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