c-Met抑制劑17-AAG和卡博替尼對(duì)小鼠體內(nèi)產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌感染的阻斷作用.pdf

1、目的：
　　通過(guò)小鼠動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，研究c-Met抑制劑17-AAG和卡博替尼對(duì)李斯特菌體內(nèi)感染的阻斷作用，探討c-Met抑制劑作為李斯特菌感染治療藥物的可行性，尋找細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌感染的治療新策略。
　　方法：
　　一、17-AAG對(duì)李斯特菌小鼠體內(nèi)感染的阻斷作用
　　1、生存曲線分析
　　將小鼠隨機(jī)分為4組:17-AAG組、氨芐青霉素組、17-AAG聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對(duì)照組，每組8只，每只小鼠腹腔注射1×

2、106CFU李斯特菌，并分別在感染后6h、12h、24h給藥，分別腹腔注射17-AAG5μg/g、腹腔注射氨芐青霉素20μg/g、腹腔注射17-AAG5μg/g后腹腔注射20μg/g氨芐青霉素、以及腹腔注射等量PBS。
　　2、血液、腦、肝、脾細(xì)菌計(jì)數(shù)
　　(1)劑量依賴效應(yīng)
　　取24只小鼠，將小鼠隨機(jī)分為0、2μg/g、5μg/g、10μg/g17-AAG四種劑量組，每組6只。
　　(2)協(xié)同作用
　　

3、取24只小鼠，隨機(jī)分為17-AAG組、氨芐青霉素組、17-AAG聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對(duì)照組，每組6只。
　　3、循環(huán)血腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(cBMECs)的計(jì)數(shù)
　　(1)劑量依賴效應(yīng)
　　小鼠隨機(jī)分為0、2μg/g、5μg/g、10μg/g17-AAG四種劑量組，每只小鼠腹腔注射5×105CFU李斯特菌，分別于給菌前2h和給菌后24h腹腔注射相應(yīng)劑量17-AAG，給菌后48h解剖小鼠，取心臟血液，并裂解紅細(xì)胞。

4、>　　(2)協(xié)同作用
　　小鼠隨機(jī)分為17-AAG組、氨芐青霉素組、17-AAG聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對(duì)照組，每只小鼠腹腔注射5×105CFU李斯特菌，分別在感染后2h、6h、24h給藥，各組分別腹腔注射17-AAG5μg/g、腹腔注射氨芐青霉素20μg/g、腹腔注射17-AAG5μg/g后腹腔注射20μg/g氨芐青霉素、以及腹腔注射等量PBS，給菌48h后，解剖取其心臟血，計(jì)數(shù)cBMECs。
　　4、腦組織中依文思藍(lán)(E

5、B)含量的測(cè)定
　　(1)劑量依賴效應(yīng)
　　小鼠隨機(jī)分為不同17-AAG劑量組，給菌給藥，方法同2(1)，于解剖前3h腹腔注射EB(50μg/g)，存活3h后，麻醉，用30mL預(yù)冷PBS心臟灌注，打開(kāi)頭顱，取出腦組織，放入含有1mL去離子甲酰胺的EP管內(nèi)，50℃水浴48h，5200rpm離心10min，取上清液，620nm分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，根據(jù)吸光度在繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得EB的濃度。
　　(2)協(xié)同作用
　　

6、小鼠隨機(jī)分為17-AAG組、氨芐青霉素組、17-AAG聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對(duì)照組，給菌給藥，方法同2(2)，于解剖前3h腹腔注射EB，測(cè)定腦組織中EB含量。
　　5、腦脊液(CSF)中NF-κB p65的測(cè)定
　　(1)劑量依賴效應(yīng)
　　小鼠隨機(jī)分為不同17-AAG劑量組，給菌給藥，方法同2(1)，給菌48h后，解剖小鼠，取出小鼠腦組織，用200μLPBS沖洗腦室和顱腔以收集腦脊液，10μLCSF中含有10個(gè)紅細(xì)胞

7、的標(biāo)本視為污染標(biāo)本，然后用小鼠NF-κB p65ELISA試劑盒測(cè)定腦脊液中p65的含量。
　　(2)協(xié)同作用
　　小鼠隨機(jī)分為17-AAG組、氨芐青霉素組、17-AAG聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對(duì)照組，給菌給藥方法同2(2)，給菌48h后，取其CSF測(cè)定p65含量。
　　6、IL-10的檢測(cè)
　　小鼠隨機(jī)分為17-AAG組、氨芐青霉素組、17-AAG聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對(duì)照組，給菌用藥方法同2(2)，給菌48

8、h后，解剖小鼠，采集心臟血，于2-8℃5200rpm離心15分鐘，30分鐘內(nèi)收集好血清，用IL-10 ELISA試劑盒檢測(cè)IL-10含量。
　　7、肝臟病理學(xué)分析
　　采集PBS對(duì)照組和10μg/g17-AAG劑量組小鼠肝臟組織，于10％甲醛固定后，經(jīng)水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片、貼片、烤片、HE染色、封片后，于顯微鏡下進(jìn)行病理觀察。
　　二、卡博替尼對(duì)李斯特菌小鼠體內(nèi)感染的阻斷作用
　　1、生存曲線

9、分析
　　將小鼠隨機(jī)分為4組:卡博替尼組、氨芐青霉素組、卡博替尼聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對(duì)照組，每組9只，每只小鼠腹腔注射1×106CFU李斯特菌，并分別在感染后6h、12h、24h給藥，各組分別灌胃給予卡博替尼20μg/g、腹腔注射氨芐青霉素20μg/g、灌胃卡博替尼20μg/g后腹腔注射20μg/g氨芐青霉素、以及腹腔注射等量PBS，每天記錄觀察小鼠的臨床癥狀和生存情況，共5d。
　　2、血液、腦組織細(xì)菌計(jì)數(shù)
　　

10、(1)劑量依賴效應(yīng)
　　將小鼠隨機(jī)分為0、10μg/g、20μg/g、30μg/g卡博替尼四種劑量組，每組5只。每只小鼠腹腔注射5×105CFU李斯特菌，分別于給菌前2h和給菌后24h灌胃相應(yīng)劑量卡博替尼。給菌后48h，給予小鼠10％水合氯醛200μL，打開(kāi)其胸腔，從心尖處抽取200μL血液，倍比稀釋后，涂布于BHI固體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。灌洗后無(wú)菌打開(kāi)頭顱，取出腦組織，用組織勻漿器研磨，倍比稀釋后，計(jì)數(shù)細(xì)菌菌落數(shù)。
　　(

11、2)協(xié)同作用
　　將小鼠隨機(jī)分為卡博替尼組、氨芐青霉素組、卡博替尼聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對(duì)照組，每只小鼠腹腔注射5×105CFU李斯特菌，分別在感染后2、6、24h給藥，各組分別灌胃給予卡博替尼20μg/g、腹腔注射氨芐青霉素20μg/g、灌胃卡博替尼20μg/g后腹腔注射20μg/g氨芐青霉素、以及腹腔注射等量PBS，給菌后48h，無(wú)菌取其血液和腦組織，計(jì)數(shù)細(xì)菌菌落數(shù)。
　　3、循環(huán)血腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的計(jì)數(shù)
　　小

12、鼠隨機(jī)分為卡博替尼組、氨芐青霉素組、卡博替尼聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對(duì)照組，給菌給藥方法同2(2)，感染李斯特菌48h后，解剖取其心臟血，并裂解紅細(xì)胞。按照說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備好磁珠，并用Hanks平衡鹽溶液和5％FBS混合液(HBSS+5％FCS)重懸至終濃度為4×108個(gè)/mL。
　　4、IL-10的檢測(cè)
　　小鼠隨機(jī)分為卡博替尼組、氨芐青霉素組、卡博替尼聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對(duì)照組，給菌用藥方法同2(2)，給菌48h后，采集心

13、臟血，于2-8℃5200rpm離心15分鐘，30分鐘內(nèi)收集好血清，用IL-10ELISA試劑盒檢測(cè)IL-10含量。
　　5、腦脊液中NF-κB p65的測(cè)定
　　小鼠隨機(jī)分為卡博替尼組、氨芐青霉素組、卡博替尼聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對(duì)照組，給菌用藥方法同2(2)，解剖小鼠，取出小鼠腦組織，用200μLPBS沖洗腦室和顱腔以收集腦脊液(CSF)，10μLCSF中含有10個(gè)紅細(xì)胞的標(biāo)本視為污染標(biāo)本，然后用小鼠NF-κB p65

14、ELISA試劑盒測(cè)定腦脊液中p65的含量。
　　6、腦組織中依文思藍(lán)含量的測(cè)定
　　小鼠隨機(jī)分為卡博替尼組、氨芐青霉素組、卡博替尼聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對(duì)照組，給菌給藥方法同2(2)，小鼠于解剖前3h腹腔注射EB（50μg/g），存活3h后，麻醉，用30mL預(yù)冷PBS心臟灌注，打開(kāi)頭顱，取出腦組織，放入含有1mL去離子甲酰胺的EP管內(nèi)，50℃水浴48h，5200rpm離心10min，取上清液，620nm分光光度計(jì)測(cè)定吸光度

15、，根據(jù)吸光度在繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得EB的濃度。
　　7、腦組織病理學(xué)分析
　　采集腦組織，于10％甲醛固定后，經(jīng)水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片、貼片、烤片、HE染色、封片后，于顯微鏡下進(jìn)行病理觀察。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　本研究的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組的比較運(yùn)用t檢驗(yàn)，運(yùn)用GraphPadPrism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
　　結(jié)果：<

16、br>　　一、17-AAG對(duì)李斯特菌小鼠體內(nèi)感染的阻斷作用
　　1.17-AAG組、氨芐青霉素組、17-AAG聯(lián)合氨芐青霉素組感染小鼠的生存率均明顯高于PBS對(duì)照組。
　　2.17-AAG呈劑量依賴性抑制李斯特菌在小鼠血液、腦組織、肝臟、脾臟的增殖，并呈劑量依賴性減少血液cBMECs數(shù)量、腦組織中EB含量、腦脊液中NF-κB p65含量。
　　3.17-AAG聯(lián)合氨芐青霉素組相比單獨(dú)用藥組，小鼠血液、腦組織、肝臟、脾臟

17、的李斯特菌數(shù)量、cBMECs數(shù)量、腦組織中EB含量、腦脊液中NF-κB p65含量均顯著降低。
　　4.17-AAG用藥組相比PBS對(duì)照組，小鼠肝臟組織病理變化減輕。
　　二、卡博替尼對(duì)李斯特菌小鼠體內(nèi)感染的阻斷作用
　　1.卡博替尼組、氨芐青霉素組、卡博替尼聯(lián)合氨芐青霉素組感染小鼠的生存率明顯高于PBS對(duì)照組。
　　2.卡博替尼呈劑量依賴性降低感染小鼠血液、腦組織中李斯特菌數(shù)量。
　　3.卡博替尼聯(lián)合氨芐

18、青霉素用藥組相比于單獨(dú)用藥組，外周血cBMECs數(shù)量、腦組織中EB含量、腦脊液中NF-κB p65含量、血液IL-10含量均顯著降低。
　　4.聯(lián)合用藥組和單獨(dú)用藥組腦組織炎癥變化均較PBS組減輕，其中聯(lián)合用藥組僅見(jiàn)少量的炎癥細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　c-Met受體酪氨酸激酶抑制劑17-AAG和卡博替尼能夠在一定程度上抑制李斯特菌在小鼠體內(nèi)增殖，阻斷李斯特菌菌血癥和腦膜炎的發(fā)生，并與氨芐青霉素可能具有一定程度上的協(xié)同作用