2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、背景與目的:
  產(chǎn)單核細胞李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)簡稱單增李斯特菌,是李斯特菌屬內(nèi)唯一對人類致病的菌種。在臨床治療中,盡管抗生素已經(jīng)有效地應用于各種感染性疾病的治療,但是面對LM感染所導致的高致病率和高病死率,我們往往素手無策。LM對人體的感染多發(fā)生于免疫力低下的人群,如老年人、兒童、孕婦、長期服用免疫抑制劑的病人及患有免疫系統(tǒng)疾病的人群等等。LM的感染多由于消化道感染引起,攝入被LM污染的

2、食物后,產(chǎn)單核細胞李斯特菌可粘附并侵襲腸道上皮細胞,其入侵腸道的重要毒力因子是產(chǎn)單核細胞李斯特菌表面的內(nèi)化素B(Internalin B,InlB)。
  本文主要從以下幾個方面開展研究:(1)體外培養(yǎng)的人結(jié)腸腺癌細胞(Caco-2 cells)及HBMECs,從而研究17-AAG和XL-184在阻止LM侵襲Caco-2細胞和HBMEC中所起的作用;(2)將Caco-2細胞和HBMEC接種于Transwell小室,并測量17-AA

3、G和XL-184孵育后單層細胞的跨膜電阻和滲透性,從而研究c-Met受體阻斷劑卡在保護細胞屏障的完整性中所扮演的角色;(3)體外培養(yǎng)Caco-2細胞和HBMEC,并使用熒光染色技術(shù)(DAPI/PI)和乳酸脫氫酶(LDH)釋放水平檢測技術(shù),從而研究在17-AAG和XL-184的介入下,LM所致細胞凋亡率的變化情況。
  方法:
  1、檢測LM濃度并繪制LM與OD值的相關(guān)曲線
  將LM培養(yǎng)至對數(shù)生長期,取100μl菌液

4、于離心機中離心,轉(zhuǎn)速10000 rpm,去上清。將細菌沉淀重懸于磷酸鹽緩沖液(即PBS)中。菌液濃度稀釋至1×10-1~-10并于紫外分光光度計600 nm處測量OD值。將各濃度的菌液取100 ul涂布于無抗生素的BHI固體平板上,37℃孵箱孵育24 h,計數(shù)菌落數(shù)量,并分析菌落數(shù)量、菌液各稀釋度與OD值之間的關(guān)系。
  2、c-Met受體阻斷劑作用下LM生長曲線的測定
  配制體積為5 ml分別含XL-184濃度為0、0.

5、05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5和10μM的BHI液體培養(yǎng)基,同時于培養(yǎng)基中加入100μl處于對數(shù)生長期的LM,37℃、200 rpm搖床中孵育LM。分別于0、2、4、6、8、10、12、14和16h取100μl菌液于96孔板中,酶標儀600 nm波長處測量吸光度值。以時間為橫坐標,以A600處的吸光度值為縱坐標繪制LM生長曲線。
  3、研究LM對Caco-2和HBMEC的侵襲實驗
  人結(jié)腸腺癌細胞Caco

6、-2及HBMEC體外培養(yǎng)于24孔板,待細胞匯合成單層(約105/孔)后進行試驗。實驗方法為:細胞單層加入無抗生素的培養(yǎng)基和LM(約107/孔,使細胞感染倍數(shù)為100),37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)90 min,無菌PBS洗三次,加入含慶大霉素100μg/ml的培養(yǎng)基孵育細胞1h,達到抑制胞外細菌的作用。再用無菌PBS洗三遍,取100μl/孔0.5%TritonⅩ-100于24孔板,孵育8 min后,立即加入50μl蒸餾水中止Triton

7、Ⅹ-100的裂解作用。裂解液梯度稀釋(101-104)后涂板培養(yǎng),24 h后計數(shù)并計算LM侵襲率。
  4、c-Met受體阻斷劑單獨或與氨芐西林聯(lián)合作用下LM對Caco-2和HBMEC的侵襲實驗
  為了研究c-Met受體阻斷劑17-AAG和XL-184在阻止LM侵襲Caco-2和HBMEC中所起的作用,首先體外培養(yǎng)Caco-2和HBMEC于24孔板,待細胞匯合成單層(約105/孔)并形成緊密連接后,于不同的時間、不同濃度的

8、17-AAG和XL-184單獨或與氨芐西林(Ampicillin,AMP)聯(lián)合孵育Caco-2和HBMEC,孵育完畢后加入LM(約107/孔,使細胞感染倍數(shù)為100),洗單層細胞三次并加入含有慶大霉素100μg/ml的培養(yǎng)基孵育1h,再次洗單層細胞三次后用0.5% TritonⅩ-100裂解細胞,裂解液梯度稀釋(10-1-10-4)后涂板培養(yǎng),24 h后計數(shù)并計算LM侵襲率。
  5、c-Met受體阻斷劑作用下單層細胞通透性的檢測

9、
  Caco-2和HBMEC接種于Transwell小室上層,生長于聚碳酸酯膜的Caco-2或HBMEC,其細胞膜上的緊密連接結(jié)構(gòu)形成一道相對緊密的屏障以阻止小分子物質(zhì)通過細胞單層,并可將transwell分為上下室,Caco-2和HBMEC可分別視為模擬血-腸屏障和血-腦屏障。接種Caco-2和HBMEC的上層小室分別加入含不同濃度XL-184的MEM培養(yǎng)基和含不同濃度的17-AAG的1640培養(yǎng)基,孵育24 h,無菌PBS洗

10、細胞三次,加入細菌(MOI=100)孵育1.5 h,隨后加入HRP3μg于37℃孵育。分別于0、2、4、6h從下層取30μl培養(yǎng)基涂布于不含抗生素的BHI固體平板,然后將培養(yǎng)基置于37℃細菌培養(yǎng)箱中24 h后觀察并計數(shù)菌落數(shù)量。酶標儀于405 nm處測量檢測下室MEM和1640培養(yǎng)基中HRP的濃度。電阻儀測量TEER值以觀察單層細胞通透性的改變情況。從下室取出培養(yǎng)基用于檢測后應加入同等體積的無菌培養(yǎng)基,使得下室培養(yǎng)基體積始終保持為2ml

11、。
  結(jié)果:
  1、c-Met阻斷劑對體外LM生長曲線無影響
  在不同時間下,含不同濃度XL-184的BHI液體培養(yǎng)基中,LM的生長情況無差異。實驗組與對照組相比,LM生長曲線形狀相似,無統(tǒng)計學差異。
  2、致病菌LM對Caco-2細胞和HBMEC的侵襲率高于非致病菌DH5a、BL21(DE3)
  對于Caco-2細胞:LM侵襲率約為0.168%,高于對照組DH5α的侵襲率0.019%(P=0.0

12、00)、高于BL21(DE3)的侵襲率0.023%(P=0.000)。
  對于HBMEC:LM侵襲率約為0.129%,高于對照組DH5α的侵襲率0.024%(P=0.000)、高于BL21(DE3)的侵襲率0.027%(P=0.000)。
  3、c-Met阻斷劑可降低LM對于Caco-2細胞及HBMEC的侵襲率
  藥物組侵襲率均低于對照組(P=0.000)。隨XL-184濃度升高,LM對Caco-2、HBMEC的

13、侵襲率降低。相同劑量藥物作用下,XL-184孵育Caco-2細胞1,2,6,12h即可降低LM的侵襲率。XL-184孵育HBMEC1,2,6h即可降低LM的侵襲率。隨17-AAG濃度增高,LM對Caco-2的侵襲率有下降趨勢。17-AAG孵育細胞1h即可明顯降低LM對Caco-2的侵襲。
  4、XL-184與AMP聯(lián)合用藥對于抑制LM侵襲Caco-2、HBMEC的效果優(yōu)于XL-184單獨用藥
  各濃度XL-184分別與5

14、0μg/ml AMP共孵育Caco-2細胞24 h;實驗組LM對Caco-2的侵襲率低于對照組(P0~1<0.01,P5<0.05);隨XL-184劑量增大,LM對Caco-2的侵襲率有下降趨勢。
  各濃度Amp分別與0.1μM XL-184共孵育Caco-2細胞24 h;實驗組LM對細胞的侵襲率均低于對照組(P<0.01);且隨氨芐西林劑量增大,LM對Caco-2的侵襲率有下降趨勢。
  各濃度XL-184分別與50μg

15、/ml氨芐西林共孵育HBMEC24 h,實驗組LM對細胞的侵襲率低于對照組(P=0.000);隨XL-184劑量增大,LM對HBMEC的侵襲率有下降趨勢。
  各濃度Amp分別與0.1μM XL-184共孵育細胞24 h,實驗組LM對細胞的侵襲率均低于對照組(P=0.000);隨氨芐西林劑量增大,LM對HBMEC的侵襲率有下降趨勢。
  5、17-AAG與氨芐西林聯(lián)合用藥對于抑制LM侵襲Caco-2的效果優(yōu)于17-AAG單獨

16、用藥
  各濃度17-AAG分別與50μg/ml Amp共孵育細胞24 h,實驗組LM對Caco-2的侵襲率低于對照組(P0=0.000,P50~100<0.05,P250~500<0.01);隨17-AAG劑量增大,LM對Caco-2的侵襲率有下降趨勢。
  各濃度AMP分別與50 nM17-AAG共孵育細胞24 h,實驗組LM對Caco-2的侵襲率低于對照組(P0=0.000,P5<0.01,P25~50<0.05,P1

17、00>0.05);且隨藥物劑量增大,LM對Caco-2的侵襲率有下降趨勢。
  結(jié)論:
  1、c-Met阻斷劑在體外不能抑制LM的生長。
  2、c-Met阻斷劑可降低LM對于細胞的侵襲。
  3、c-Met阻斷劑與青霉素類抗生素聯(lián)合應用可有效降低LM對于細胞的侵襲。
  4、c-Met阻斷劑通過降低LM對于細胞的侵襲進而抑制LM對細胞所產(chǎn)生的有害作用。
  5、c-Met阻斷劑通過降低LM介導的有

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