李斯特菌對(duì)瘧原蟲(chóng)感染的免疫保護(hù)作用.pdf

1、前言:
　　 瘧疾是由瘧原蟲(chóng)感染引起的嚴(yán)重威脅人類生命的感染性疾病之一，但目前尚未有應(yīng)用于臨床的有效瘧疾疫苗。動(dòng)物模型和人體研究的結(jié)果均已表明:CD4+T細(xì)胞在抵抗紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng)感染過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。感染急性期以IFN-γ為主導(dǎo)的Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答及巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活化可有效地遏制瘧原蟲(chóng)的爆發(fā)性增殖。對(duì)于瘧原蟲(chóng)的肝內(nèi)期感染階段，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明保護(hù)性作用有賴于CD8+T細(xì)胞活化所介導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，CD4+T

2、、IFN-γ及中和性抗體也發(fā)揮重要作用。因此有效提高細(xì)胞免疫應(yīng)答成為抗瘧疫苗研究的重要策略。
　　 單核增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)是一種革蘭陽(yáng)性胞內(nèi)寄生菌，它可引起人類食物源性感染。該菌的生物學(xué)特性及其誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的特點(diǎn)使其成為極好的疫苗載體。在抗腫瘤、抗感染以及免疫調(diào)節(jié)等方面的作用越來(lái)越受到關(guān)注。同時(shí)Lm的自然感染途徑是經(jīng)口感染，因而可誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答。它相對(duì)安全，對(duì)健康人的致病力較弱

3、，近年來(lái)制備了多種減毒株，部分已通過(guò)Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)，安全性獲得認(rèn)證。
　　 本研究中，我們建立了Lm與鼠瘧共同感染模型，觀察到Lm處理對(duì)P.y17XL感染小鼠具有保護(hù)作用。我們進(jìn)一步研究了Lm在瘧原蟲(chóng)感染進(jìn)程中的免疫修飾作用及其產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制，為瘧疾的疫苗研制提供新的思路。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、瘧原蟲(chóng)及菌株
　　 6～8周雌性C57BL/6、BALB/c小鼠，SPF級(jí)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科

4、學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供（許可證編號(hào):SCXK京200420001）。致死型約氏瘧原蟲(chóng)P.y17XL(Plasmodiumyoelii17XL)液氮凍存，由BALB/c小鼠周期性復(fù)蘇傳代。野生型李斯特菌Lm10403s由BALB/c小鼠傳代后于TSB培養(yǎng)液中-80℃保存。熱滅活李斯特菌(Heat-killed Lm，HKLm)由對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Lm10403s PBS重懸后80℃熱滅活1h，-80℃凍存?zhèn)溆谩?br>　　 2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染

5、r>　　 瘧疾感染:C57BL/6、BALB/c每只小鼠經(jīng)腹腔感染5×105P.y17XL寄生紅細(xì)胞。P.y17XL感染后第3天開(kāi)始，尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)原蟲(chóng)血癥水平、生存率。
　　 Lm感染:于P.y17XL感染兩天后（除在文中特殊注明外）經(jīng)尾靜脈感染李斯特菌，Lm10403s感染劑量400ul，BALB/c1×103 CFU，C57BL/61×104 CFU，HKLm感染劑量400ul，1×1

6、09 CFU。對(duì)照組注射同等劑量PBS。
　　 3、脾細(xì)胞培養(yǎng)
　　 無(wú)菌摘取小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液，用含10％FCS的RPMI1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度至1×107個(gè)/ml，于24孔培養(yǎng)板(Costar)中，每孔加入500ul細(xì)胞懸液，一式3孔，培養(yǎng)48h。收集培養(yǎng)上清，于-80℃保存，待NO測(cè)定。
　　 4、流式細(xì)胞術(shù)
　　 FACS檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞CD4+T、CD8+T、CD11b+各細(xì)胞群百

7、分比及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ分泌情況，使用WINMDI2.9進(jìn)行分析。
　　 5、NO水平檢測(cè)
　　 Griess試劑檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO含量，100ul細(xì)胞培養(yǎng)上清液和100ulGriess反應(yīng)液室溫反應(yīng)10min，酶標(biāo)儀檢測(cè)550nm處OD值。以NaNO2作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行濃度換算。
　　 6、Realtime PCR檢測(cè)細(xì)胞因子
　　 TRIzol勻漿提取脾臟組織mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，保存

8、于-20℃作為RealtimePCR的模版，將RPS17作為內(nèi)參基因，檢測(cè)IFN-γ、 IL-4、IL-12P40及IL-10基因表達(dá)水平。
　　 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，標(biāo)本采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、接種Lm對(duì)P.y17XL感染小鼠原蟲(chóng)血癥水平及生存率的影響Lm抵抗品系C57BL/6小鼠

9、在不同時(shí)間接種Lm的三組小鼠原蟲(chóng)血癥水平均低于單獨(dú)感染P.y17XL對(duì)照組，并未觀察到生存率的差異;對(duì)Lm及P.y17XL更加易感的BALB/c小鼠Lm組在P.y17XL感染4天后相對(duì)于對(duì)照組原蟲(chóng)血癥水平明顯下降，生存時(shí)間延長(zhǎng)。
　　 2、接種Lm對(duì)P.y17XL感染C57BL/6小鼠Th1型應(yīng)答的影響
　　 P.y17XL感染后第5天，接種Lm的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子IFN-γ分泌水平與對(duì)照組相比明顯

10、升高，Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平無(wú)明顯差異;Lm組CD11b+細(xì)胞百分比出現(xiàn)明顯升高，脾細(xì)胞培養(yǎng)上清NO水平也顯著高于對(duì)照組;Lm組CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組基本相同，但Lm組CD4+、CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ的水平與對(duì)照組相比，明顯升高。
　　 3、IFN-γ與Lm對(duì)P.y17XL感染保護(hù)作用的關(guān)系
　　 P.y17XL感染后第3天（Lm感染后一天），Lm組IFN-γ分泌水平與對(duì)照組相比明顯

11、升高約5倍，HKLm組IFN-γ分泌水平與對(duì)照組相似，Lm組IL-12水平較低，與另兩組無(wú)差異。對(duì)照組IL-4水平相比另兩組出現(xiàn)有意義升高。C57BL/6小鼠HKLm組、Lm組蟲(chóng)血癥在P.y17XL感染后的前5天相比于對(duì)照組一直保持在較低水平，Lm組5天后逐漸下降，并始終在保持10％以下，但HKLm組5天后開(kāi)始逐漸上升至第8天與對(duì)照組基本一致。
　　 結(jié)論:
　　 1、Lm對(duì)P.y17XL感染的小鼠具有免疫保護(hù)作用;