李斯特菌對食品的污染及其防治分析

1、李斯特菌對食品的污染及其防治,一、概況：,李斯特氏菌是一種格蘭氏陽性菌，形狀為圓尾帶柱，它是一種非芽孢兼性厭氧菌。 李斯特菌在環(huán)境中無處不在，在絕大多數(shù)食品中都能找到李斯特菌。肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等都已被證實(shí)是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒嚴(yán)重的可引起血液和腦組織感染，很多國家都已經(jīng)采取措施來控制食品中的李斯特菌，并制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。目前國際上公認(rèn)的李斯特菌共有七個菌株：,單核細(xì)胞增生李斯特(L.mono

2、cytohenes) 綿羊李斯特菌 (L.iuanuii) 英諾克李斯特菌 (L.innocua) 威爾斯李斯特菌 (L.welshimeri) 西爾李斯特菌 (L.seeligeri) 格氏李斯特菌 (L.grayi) 默 氏 李 斯 特 菌 (L.murrayi),其中單增李斯特菌是主要能引起人類疾病的菌。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表

3、現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李氏菌對人類的安全具有危險(xiǎn)，該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。,二、李斯特菌的來源,１、人　　首先，人能傳播這種感染。特別是在醫(yī)院里，通過人和人的接觸尤易感染。據(jù)報(bào)道，健康人群糞便中l(wèi)m的攜帶率為0.6－16%，有70％的人可短期帶菌。據(jù)有關(guān)研究表明，大約有５％到１０％的健康人群攜帶有這個病菌。,２、動物及環(huán)境　　李斯特菌傳

4、播給人類的主要途徑是通過水源到廚房的食物鏈中的任何一個環(huán)節(jié)。它既能隨食品原料進(jìn)入食品加工廠，也可由灰塵或排泄物經(jīng)工作人員帶入，污染工作場所機(jī)機(jī)械設(shè)備，進(jìn)而污染食品。直接或間接的接觸動物，都有可能成為感染李斯特菌的來源。牛和羊類都能成為李斯特菌的攜菌體。從環(huán)境方面來說，李斯特菌（Ｌｍ）也廣泛地存在于環(huán)境中。因此，食品從環(huán)境當(dāng)中受到李斯特菌（Ｌｍ）的機(jī)會是很大的。,從食品工廠來說，在后處理階段，特別重要的是防止從工廠設(shè)施和機(jī)器中受到污染。

5、３、食品　　食品能在食品鏈中的任何一個環(huán)節(jié)受到李斯特菌（Ｌｍ）的污染，包括從原產(chǎn)地，到工廠的加工過程，進(jìn)入分銷環(huán)節(jié)，直致進(jìn)入消費(fèi)者的廚房。這個情況在那些潮濕氣候的地區(qū)尤為顯著。前已述及，李斯特菌可以在許多食品中得到感染，如牛奶、乳酪、生家禽和家畜肉、發(fā)酵香腸、蔬菜和海產(chǎn)品（4－8%）。,當(dāng)然，有些食品被檢出其它類型的非Ｌｍ李斯特菌，可能不會引起人的感染，然而，其存在的事實(shí)勿庸置疑表明：操作過程的衛(wèi)生狀況需要立即加以改進(jìn)。我們特別要注

6、意，對于那些操作溫度較高，保質(zhì)期較短且常在冷藏條件下保存的食品通常都是李斯特菌的適宜生長環(huán)境。,三、控制因素,李斯特菌的感染最近呈上升趨勢，在美國，１９６７－１９６９報(bào)告有２５５個感染例，然而，在１９８７年，這個數(shù)字卻達(dá)到了１５００。要想?yún)^(qū)分哪些李斯特菌的感染是來源于食品，或者說，分別區(qū)分出來源于食品或非食品，卻是很困難的。原因是它有很長的潛伏期。根據(jù)記載，第一例確定由食品引起的李斯特菌感染在１９８１年，發(fā)生在加拿大的一次沙拉制品的較大

7、規(guī)模的污染事件。,在那次事件中，有４１例被感染，７例致死。根據(jù)調(diào)查，原因是其中的卷心菜受到了李斯特菌的污染。污染源又是通過做為肥料的羊糞而來。這些羊被懷疑感染了李斯特菌。其后，在美國、瑞士、英國、法國又相繼發(fā)生了李斯特菌的污染事件。牽涉到的食品有牛奶、乳酪、豬肉、生乳制品等。因此,有效的控制和預(yù)防被提到了一個及其重要的位置。以下，列舉一些重要的控制因素。,１、溫度　　李斯特菌Ｌｍ是在能引起食品傳染的致病菌中的比較特殊的一種。其原因是它

8、屬適冷細(xì)菌，李斯特菌能在2.5～42℃的溫度下生存(有的資料講在０～４４℃溫度條件下能生長)，以４～６℃時繁殖最快。李斯特菌Ｌｍ能在冷凍產(chǎn)品中存活至幾個星期，在酸性條件下較為困難。,２、抗熱性　　李斯特菌Ｌｍ不是一種特別的抗熱菌種，它不是芽孢菌，因此可以在巴氏滅菌的條件下被破壞。然而，相比較另一些食品致病菌，它的抗熱性要好一些。根據(jù)實(shí)驗(yàn)，一套良好的滅菌乳系統(tǒng)能將生乳的Ｌｍ控制在正常單位以下。對于肉制品而言，至少要保證７０℃和２分鐘以上

9、的加熱時間。如果加熱過程不穩(wěn)定，則可能減低殺菌效果。,３、ＰＨ　　同其它細(xì)菌一樣，李斯特菌在酸性條件下的存活能力取決于酸的種類和溫度。通常能在ＰＨ小于５的條件下得以生長，其中，李斯特菌得以生長的最低的ＰＨ值據(jù)記錄是在ＰＨ４．３。在冷藏條件下，它能生長的最低ＰＨ值線有所提高，據(jù)研究表明在ＰＨ５．２。,４、水分活性及鹽　　李斯特菌Ｌｍ單是一種能承受高離子濃度和低水分活性的菌種。它能夠在１０％的ＮＡＣＬ溶液內(nèi)甚至更高的濃度下得以存活甚至生

10、長；同時，也能在水分活性０．９２的條件下生長。其最低限隨溫度及溶劑的不同而稍有差異。 備注:水分活性AW來表示。其定義為食品所顯示的水蒸汽壓P對在同一溫度下純水的蒸汽壓P0之比:Aw=P / Po水分子會從水中蒸發(fā)跑到空氣中成為氣體，即水蒸汽，而氣體都有一定壓力，水蒸汽的壓力就稱為水蒸汽壓，一般食品不僅含有水，而且含有蛋白質(zhì)，淀粉等固形物，所以它的水相對地就比純水少，故其水蒸汽壓也就小，即一般有P＜P0，所以AW值皆小于1。,５

11、、空氣　　在微生物實(shí)驗(yàn)中，用肉湯培養(yǎng)基顯示厭氧培養(yǎng)有助于Ｌｍ的生長。同時，另一些實(shí)驗(yàn)表明在缺氧狀態(tài)下，Ｌｍ能在３℃到７℃的條件下在肉類中繁殖。同樣，在３－１０％的充二氧化碳的條件下，Ｌｍ能在５℃的條件下在不同種的蔬菜中得以生長。然而，高濃度的二氧化碳（８０％）能抑制。,四、殺滅條件,該菌對理化因素抵抗力較強(qiáng)60－70℃經(jīng)5－20min可殺死，70％酒精5min，2.5％石炭酸（氫氧化鈉，福爾馬林）20min可殺死此菌。該菌對青霉素，四

12、環(huán)素，磺胺均敏感。,五、監(jiān)控頻率,對加工環(huán)境較濕的應(yīng)每周檢測一次，較干的需每月監(jiān)控一次。 若監(jiān)控環(huán)境的檢測結(jié)果不理想,則返回監(jiān)控在一定時間內(nèi)生產(chǎn)的產(chǎn)品,檢測產(chǎn)品是否受到影響.,六、檢驗(yàn)方法：,（一） 國標(biāo)法 (常規(guī)法) 1、增菌培養(yǎng)　　取回的樣品應(yīng)在4℃下處理、存放和運(yùn)送，如果是冷凍樣品，則在檢驗(yàn)前要保持冷凍狀態(tài)?！　∪?5mL液體或25g半固體或固體樣品放入含有225mL無選擇性試劑增菌肉湯（EB）的均質(zhì)杯中進(jìn)行均質(zhì)，

13、然后轉(zhuǎn)入三角瓶中，30℃培養(yǎng)4h，加入選擇性試劑吖啶黃素、萘啶酮酸和放線菌酮，繼續(xù)培養(yǎng)20h和44h.。,2、分離　　共培養(yǎng)24h和48h后，取EB培養(yǎng)物分別在OXA和LPM或加七葉苷/Fe3+LPM瓊脂平板上劃線。PALCAM瓊脂可替代LPM瓊脂。將OXA和PALCAM平板置于35℃培養(yǎng)24-48h，LPM平板在30℃培養(yǎng)24-48h。然后，把LPM平板放于解剖鏡載物臺上，以450角入射光從平板下面照射平板，通過目鏡垂直向下觀察尋找

14、可疑菌落。李斯特氏菌在LPM平板上呈有光澤的蘭色或灰色。用已知陽性菌和陰性菌劃線的平板作對照。,加入七葉苷和Fe3+的LPM平板不用斜射光系統(tǒng)，選擇可疑菌落的方法與在OXA上選擇可疑菌落的方法相同。在OXA平板上李斯特氏菌菌落周圍有一個黑色環(huán)，其它菌也可形成黑色環(huán)，但形成時間要在兩天以上。李斯特氏菌在PALCAM和OXA平板上的菌落特征相似。,在PALCAM和OXA或LPM平板上挑取5個或更多的典型菌落，分別劃線于TSAYE平板上以得到

15、更純、更典型的單個菌落。食品檢驗(yàn)中在TSAYE平板上純化是必須的，因?yàn)樵赑ALCAM和OXA或LPM平板上分離菌落時可能沾有不可見的受抑微生物。挑取5個典型菌落的原因是一個樣品中可能分離到一種以上的李斯特氏菌。30℃TSAYE平板培養(yǎng)24-48h，如果不用于動力觀察，也可在35℃培養(yǎng)。,3、鑒定步驟（1）觀察TSAYE平板通過斜射光觀察，尋找呈蘭灰至蘭色菌落。在TSAYE上用已知菌作對照。（2）、從30℃或更低溫度下培養(yǎng)的TSAYE

16、平板上挑取典型菌落做成濕玻片在油鏡下觀察。濕玻片用0.85%生理鹽水菌懸液制成。如果菌量太少，菌體黏附于載玻片上而呈現(xiàn)非運(yùn)動性。李斯特氏菌是細(xì)短桿菌，可見輕微的旋轉(zhuǎn)及翻滾。與已知的李斯特氏菌的對照相比，球形、大的桿狀且快速泳動的都不是李斯特氏菌。,（3）挑取典型菌落進(jìn)行過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，李斯特氏菌呈過氧化氫酶陽性反應(yīng)。（4）取16-24h的培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色，李斯特氏菌呈革蘭氏陽性桿菌。但是陳舊培養(yǎng)物革蘭氏染色會發(fā)生變化，而且菌體可成

17、球形。在染色過重的玻片上菌體有呈柵狀排列的趨勢，易誤認(rèn)為白喉菌而錯判。,（5）挑取典型菌落接種于TSBYE肉湯管中，35℃培養(yǎng)24h用做糖類發(fā)酵和其它生化項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)。TSBYE肉湯管在4℃下可存放幾天，也可反復(fù)接種。（6）在TSAYE平板上挑取典型菌落刺種到5%的綿羊血或馬血瓊脂平板上，刺種時避免觸到平板底部和使瓊脂破裂，同時設(shè)陽性對照（單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和綿羊李斯特氏菌）和陰性對照（英諾克李斯特氏菌），35℃培養(yǎng)48h。單核細(xì)胞增

18、生李斯特氏菌呈窄小的β-溶血環(huán)。,（7）在明亮的光照下，觀察經(jīng)穿刺的血瓊脂平板，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和西爾李斯特氏菌圍繞穿刺點(diǎn)產(chǎn)生較清晰的β-溶血環(huán)，英諾克李斯特氏菌不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，而綿羊李斯特氏菌產(chǎn)生界限明顯的較大溶血環(huán)，在此不要試圖進(jìn)行種間的區(qū)分，但要記錄下溶血反應(yīng)的特征，CAMP試驗(yàn)可區(qū)分它們間的溶血反應(yīng)。,（8）硝酸鹽還原試驗(yàn)（選做）。用TSBYE肉湯培養(yǎng)物接種于硝酸鹽肉湯中，35℃培養(yǎng)5天后，加入0.2mL試劑A，再加入0.

19、2mL試劑B，混合，出現(xiàn)紫紅色為陽性反應(yīng)，表明硝酸鹽已被還原，如無顏色出現(xiàn)，在試管內(nèi)再加入少量鋅粉，放置1h，如出現(xiàn)紫紅色，表明硝酸鹽仍存在，未被細(xì)菌還原。只有默氏李斯特氏菌還原硝酸鹽，因此，從格氏李斯特氏菌中區(qū)分出默氏李斯特氏菌就必須進(jìn)行這唯一的試驗(yàn)。,本試驗(yàn)還有一等效試驗(yàn)，即加入0.2mL試劑A后，再加入0.2mL試劑C，出現(xiàn)橙色表明硝酸鹽已被還原。如未出現(xiàn)顏色反應(yīng)，也加入少量鋅粉，若出現(xiàn)橙色表明硝酸鹽未被還原。,（9）將TSBYE

20、培養(yǎng)物穿刺到SIM和MTM試管中，室溫培養(yǎng)7天，每日觀察，李斯特氏菌呈典型傘狀生長。在MTM中傘狀生長更典型。同時，30℃的TSBYE培養(yǎng)物在油鏡下可見細(xì)菌作翻轉(zhuǎn)運(yùn)動。,（10）將TSAYE肉湯培養(yǎng)物分別接種于0.5%（W/V）葡萄糖、麥芽糖、七葉苷、甘露醇、鼠李糖、木糖發(fā)酵管內(nèi)（可選用倒立發(fā)酵管），35℃培養(yǎng)7天，呈陽性反應(yīng)的李斯特氏菌產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。所有李斯特氏菌對葡萄糖、七葉苷、麥芽糖均能發(fā)酵，除格氏李斯特氏菌均不能發(fā)酵甘露醇。如果在

21、OXA、PALCAM或加七葉苷/Fe3+的LPM分離平板上菌落色素很明顯，則七葉苷試驗(yàn)可免做。,4、李斯特氏菌屬的區(qū)別　　將TSBYE肉湯培養(yǎng)物接種到3mLTSBYE肉湯中，35℃培養(yǎng)24h，接種2支TSAYE瓊脂斜面，35℃培養(yǎng)24h。用3mL0.01mol/l磷酸鹽緩沖液將斜面菌苔洗下，菌懸液于80℃水浴中加熱1h，以2500r/min離心30，棄去2mL上清夜，將剩余液與沉淀混勻制成菌懸液，進(jìn)行血清學(xué)玻片凝集試驗(yàn)。,5、小鼠毒力

22、試驗(yàn)　　將分離的菌株接種到10 mL TSBYE肉湯中，35℃培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)物離心、濃縮，用1mL生理鹽水制成菌懸液（濃度為1010個菌/mL），取0.1mL腹腔注射體重為16-18g 小鼠，每組5個觀察7d內(nèi)小鼠死亡情況。用已知致病的單增李斯特氏菌和非致病的英諾克李斯特氏菌相同方法進(jìn)行，做對照試驗(yàn)。,6、協(xié)同溶血（CAMP）試驗(yàn)　　在羊血瓊脂平板上平行接種β-溶血金黃色葡萄球菌（S.aureus）和馬紅球菌(R.equi),在

23、它們中間垂直劃線接種可疑菌，與兩線相近但不相交，在30℃培養(yǎng)24h-48h,檢查平板中垂直接種點(diǎn)對溶血環(huán)的影響?？拷瘘S色葡萄球菌接種點(diǎn)的單增李斯特氏菌的溶血增強(qiáng)，西爾李斯特氏菌的溶血也增強(qiáng)，綿羊李斯特氏菌在馬紅血球附近的溶血增強(qiáng)。,(二) 免疫學(xué)檢測方法,1、 自動酶聯(lián)熒光免疫檢測系統(tǒng)（VIDAS） 分析方法自動酶聯(lián)熒光免疫檢測系統(tǒng)（VIDAS）分析方法是對李斯特菌屬全部種的篩檢，VIDAS LMO則是對李斯特菌屬中主要致病菌

24、－單增李斯特菌的篩檢。,原理 ：李斯特菌的抗原鑒別是基于在VIDAS儀器內(nèi)進(jìn)行的酶聯(lián)熒光免疫分析。像吸液管的裝置是固相容器（SPR），在分析中既作為固相也作為吸液器。SPR包被有高特異的李斯特菌抗體。分析用試劑均密封于試劑條內(nèi)，分析的每一步都是自動執(zhí)行的。煮沸一定量的增菌肉湯加入試劑條，肉湯中的混合物在特定時間內(nèi)循環(huán)于SPR內(nèi)外。如果有李斯特菌抗原存在則與包被在SPR內(nèi)的單克隆抗體結(jié)合，其他沒有結(jié)合上的化合物被沖洗掉。,結(jié)合有堿性磷酸酶

25、的抗體在SPR內(nèi)外循環(huán)與結(jié)合在SPR內(nèi)壁上的李斯特菌抗原結(jié)合，最后的沖洗步驟將沒有結(jié)合的接合劑沖洗掉。底物—4-甲基傘形磷酸酮被SPR壁上的酶轉(zhuǎn)換成熒光產(chǎn)物—4-甲基傘形酮。熒光強(qiáng)度由光學(xué)掃描器測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由計(jì)算機(jī)自動分析，產(chǎn)生基于熒光測試的試驗(yàn)值與標(biāo)準(zhǔn)相比較后打印出每一個被測樣品的陽性或陰性結(jié)果報(bào)告,混合知識,,一、細(xì)菌的種類。,致病菌的生長特征和來源是進(jìn)行危害分析的基礎(chǔ)。根據(jù)細(xì)菌有無芽孢分類可分為革蘭氏陰性桿菌和革蘭氏陽性球菌和桿

26、菌。,,1）革蘭氏陰性桿菌。不產(chǎn)芽孢，主要來源于糞便?？漳c彎曲桿菌（Campylobacter spp.）；耶爾森氏腸球菌（Burcella abortis）；沙門氏菌屬（Salmonlella spp.）[如鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium）]、腸炎沙門氏菌（S.enteriditis）；志賀氏菌屬（Shigella spp.）；大腸埃希氏桿菌（Pathogenic escherichia coli），[如O157：H7大腸

27、桿菌（E.coliO157H7）]。,2）革蘭氏陽性球菌和桿菌。產(chǎn)生芽孢，與環(huán)境（如土壤污泥）相關(guān)的弧菌（Vibrio spp.）；蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、單核細(xì)胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）、肉毒梭菌（Clostridium botulinum）、金黃色葡萄球菌（Pathogenic staphylococcus

28、aureus）。,弧菌屬，如霍亂弧菌、副溶血性弧菌、其他弧菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌屬海產(chǎn)品中自身原有的細(xì)菌；沙門氏菌、志賀氏菌、致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球?qū)俸．a(chǎn)品中的非自身原有的細(xì)菌。,芽孢是細(xì)菌在生命中周期中處于休眠階段的生命體，相對于其生長狀態(tài)下營養(yǎng)細(xì)胞或其他非芽孢菌而言,對化學(xué)殺菌劑、熱力或其他加工處理具有極強(qiáng)的抵抗能力。處于休眠狀態(tài)下的芽孢是沒有危害的，但一旦食品中殘留的致病性芽孢菌的芽孢在食品中萌芽、生長，即會成為危害，使

29、食品不安全。因此，對此類食品的微生物控制必須以殺滅芽孢為目標(biāo)，顯然用于控制芽孢的加工步驟要比控制非芽孢菌需要的條件要嚴(yán)格得多。,二、大腸桿菌O157：H7,（一）概述 1、 什么是大腸菌群？大腸菌群名稱并非細(xì)菌分類命名，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語，它不代表某一個或某一屬細(xì)菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，這些細(xì)菌在生化反應(yīng)及血清學(xué)方面并非完全一致。,大腸菌群：需氧及兼性厭氧，在37℃能分解乳糖，產(chǎn)酸，產(chǎn)氣的革蘭氏染色陰

30、性無芽胞桿菌。一般認(rèn)為該菌群細(xì)菌可包括：大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。目前已被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于評價食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。,2、 什么是大腸桿菌？埃希氏菌屬的代表菌種是大腸埃希氏菌。大腸埃希氏菌俗稱大腸桿菌，它是人類和動物腸道正常菌群的成員，隨糞便排到自然界，并污染食品，本菌是組成水、食品中大腸菌群成員之一，其數(shù)目多少代表糞便污染和程度。,能引起腸道感染的大腸埃希氏菌有下列五個病原群(1)腸產(chǎn)毒性大腸埃

31、希氏菌(ETEC)產(chǎn)生ST、LT、引起嬰兒、旅游者腹瀉。(2)腸致病性大腸埃希氏菌(EPEC)寄居十二指腸、回腸、空腸。引起嬰兒腹瀉。(3)腸侵襲性大腸埃希氏菌(EIEC)有侵襲力，痢疾樣癥狀。,(4)腸出血性大腸埃希氏菌(EHEC)引起出血性結(jié)腸炎，主要菌型O157。(5)腸粘附性大腸埃希氏菌(EAEC)損害腸細(xì)胞外毒素，引起小兒頑固性腹瀉,3、 什么是大腸桿菌O157：H7？ EHEC O157:H7屬于腸桿菌科埃希氏菌屬。

32、它是腸出血性大腸桿菌(EHEC)的主要血清型。,(二)、流行特點(diǎn)：1.季節(jié)性：多發(fā)生于夏秋兩季6-9月為發(fā)病高峰。11月至次年2 月極少發(fā)病。2.地區(qū)分布：多發(fā)生于發(fā)達(dá)國家，主要以散發(fā)性為主。3.易感人群：兒童5-9歲、老人50-59歲明顯高于其它年齡組，最小3個月，最大85歲。,4.宿主：農(nóng)場動物牛、羊、豬、雞、馬、鹿、鴿子、海鷗等均可能為大腸桿菌O157的攜帶者。5.食源性E.coli O157:H7感染：牛肉、生奶、

33、雞肉及其制品，蔬菜、水果及制品等均可引起污染，其中牛肉是最主要的傳播載體。,（三）、生物學(xué)特征 1.形態(tài)與染色：革蘭氏染色陰性，無芽胞，有鞭毛。2.培養(yǎng)特性：最適生長溫度為33-42℃，37℃繁殖迅速，44-45℃生長不良，45.5℃停止生長。3.抵抗力：具有較強(qiáng)的耐酸性，pH2.5-3.0，37℃可耐受5小時；耐低溫，能在冰箱內(nèi)長期生存；在自然界的水中可存活數(shù)周至數(shù)月；不耐熱，75℃1分鐘即被滅活；對氯敏感，被1mg/L的

34、余氯濃度殺滅。,4.生化反應(yīng)：除不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵山梨醇外，其他常見的生化特征與大腸埃希氏菌基本相似，但也有某些生化反應(yīng)不完全一致。5.EHEC除其代表菌株O157:H7外，還包括O157:NM、O26:H11、O111:H8、O125:NM、O121:H19、O45:H2、O4:NM、O145:NM、O5:NM、O91:H21、O103:H2、O113:H2等血清型的部分菌株。血清學(xué)鑒定包括O抗原和H抗原的鑒定。前者可使用玻片凝集試驗(yàn)

35、或膠乳凝集試驗(yàn)；后者則應(yīng)先進(jìn)行動力試驗(yàn)，動力活潑者再進(jìn)行玻片和試管凝集試驗(yàn)。,（四）、致病性：,致病因素：E.coli O157:H7的另一個顯著特征是可產(chǎn)生大量的Vero毒素（VT），也稱作類志賀氏毒素（SLT），是EHEC的主要致病因子。,（五）、E.coli O157:H7的檢驗(yàn)1、 E.coli O157:H7快速酶觸反應(yīng)顯色培 養(yǎng)基法,快速酶觸反應(yīng)是根據(jù)細(xì)菌在其生長繁殖過程中可合成和釋放某些特異性的酶，按酶的特性，選用相

36、應(yīng)的底物和指示劑，將它們配制在相關(guān)的培養(yǎng)基中。根據(jù)細(xì)菌反應(yīng)后出現(xiàn)的明顯的顏色變化，確定待分離的可疑菌株，反應(yīng)的測定結(jié)果有助于細(xì)菌的快速診斷。這種技術(shù)將傳統(tǒng)的細(xì)菌分離與生化反應(yīng)有機(jī)的結(jié)合起來，并使得檢測結(jié)果直觀，成為今后微生物檢測發(fā)展的一個重要發(fā)展方向。,2、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)PCR技術(shù)原理為提高DNA探針的敏感性，可先將靶 DNA序列擴(kuò)增，增加 DNA數(shù)量，使其達(dá)到足夠的檢測量，若反應(yīng)以動力學(xué)為基礎(chǔ)，則能定量分析。1983年

37、 Millus和 Cetus發(fā)明了最基本的擴(kuò)增 DNA或增加樣品中特殊核苷酸片段數(shù)量的方法-聚合酶鏈反應(yīng)即PCR法。,PCR法建立在三步重復(fù)發(fā)生反應(yīng)的基礎(chǔ)上。①通過熱處理將雙股DNA變性裂解成單股DNA；②退火延伸引物至特異性寡核苷酸上；③酶促延伸引物與DNA配對合成模板，引物退火，變性DNA片段，引物雜交形成的模板可參與再次反應(yīng)。溶液中核苷酸通過酶聚合成相互補(bǔ)對的DNA片段，并能重新裂解成單股DNA成為下次PCR復(fù)制的模板。,三、沙門

38、氏菌,（一）、 傳播途徑大多通過吃進(jìn)被沙門氏菌污染的食品，吃感染了沙門氏菌的動物內(nèi)臟及蛋，人傳給人。1、肉的污染：肉及其制品的沙門氏菌檢出率美國為20-25%、英國為9.9%、日本檢查進(jìn)口家禽的污染率為10.3%、 國內(nèi)肉類沙門氏菌檢出率在1.1-39.5%。牛、馬、豬感染多呈全身丁當(dāng)，形成敗血癥。因此吃死牲畜多引起食物中毒型沙門氏菌感染。,2、蛋的污染：我國蛋及其制品沙門氏菌檢出率為3.9-43.7%，由于吃蛋引起鼠傷寒病的病例報(bào)

39、告逐漸有增加的趨勢。3、環(huán)境污染：食品在加工、運(yùn)輸、出售過程中往往被沙門氏菌污染。沙門氏菌在糞便、土壤、食品、水中可生存5個月至二年之久。,（二）、生物學(xué)特性：1、型態(tài)與染色：本屬菌為1-3um長，0.5-1um寬，需氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌，除雞沙門氏菌外都有周身鞭毛，能運(yùn)動，多數(shù)有菌毛。,2、抗原結(jié)構(gòu)：沙門氏菌具有復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)，主要有三種抗原，即菌體抗原、鞭毛抗原和表面抗原。沙門氏菌的分類原則是以菌體抗原為基礎(chǔ)分成群，每群中

40、再以鞭毛抗原來分型。菌體抗原：即為O抗原，是細(xì)菌細(xì)胞壁上的脂多糖，能耐熱100℃達(dá)數(shù)小時不破壞。鞭毛抗原：即H抗原，是蛋白，不穩(wěn)定，加熱或酒精處理都能被破壞。表面抗原：表面抗原有兩種即Vi及M抗原。,3、抵抗力:不耐熱，55℃、1h或60℃、10～20分鐘死亡，5%石炭酸或1：500升汞5分鐘內(nèi)即可將其殺滅。在水中能存活2～3周，類便中可活1～2個月，可在冰凍土壤中過冬。膽鹽、煌綠等對屬細(xì)菌的抑制作用較對其他腸道桿菌為小，故可用其

41、制備腸道桿菌選擇性培養(yǎng)基，利于分離糞便中的沙門氏菌。,（三）、 檢驗(yàn)技術(shù) 1、國標(biāo)法 ( 常規(guī)法 ) （1）、增菌培養(yǎng)（2）、分離BS、HE、XLD（木糖賴氨酸去氧膽酸鹽,粉色菌落,帶或不帶黑色中心,有時帶有金屬光澤,許多沙門氏培養(yǎng)物可有大的光澤黑色中心,或呈幾乎全部黑色中。）TSI：當(dāng)進(jìn)行斜面培養(yǎng)時，應(yīng)放松試管帽以保持需氧條件，以防止過量的H2S產(chǎn)生，影響現(xiàn)象的觀察。,（3）、鑒定 （主介氰化鉀） 從24h色氨