調(diào)控腫瘤細(xì)胞IGF-1R信號(hào)通路的關(guān)鍵分子研究.pdf

1、癌癥是一組細(xì)胞惡性增長(zhǎng)、增殖失控的不同疾病的統(tǒng)稱(chēng)。目前癌癥的治療主要包括手術(shù)、化療、放療、分子靶向治療、基因治療以及免疫治療等，但療效有限。1950年至2005年美國(guó)的癌癥死亡率僅下降5％，癌癥患者3年及5年生存率提高也不明顯。究其原因，主要是對(duì)癌癥的發(fā)生發(fā)展機(jī)制不甚清楚，無(wú)法從根本上治療癌癥。引起癌癥的原因中90％-95％是環(huán)境因素，5％-10％跟遺傳有關(guān)。常見(jiàn)的引起癌癥的環(huán)境因素包括煙草(25-30％)、飲食和肥胖(30-35％)、

2、感染(15-20％)、輻射(10％)、壓力、缺乏體力活動(dòng)和環(huán)境污染等。
　　 目前認(rèn)為生長(zhǎng)調(diào)控基因的改變導(dǎo)致了正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性腫瘤細(xì)胞。包括:促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖的基因-癌基因，抑制細(xì)胞分裂和存活的基因-抑癌基因。通過(guò)形成新的癌基因，不正常的癌基因的過(guò)度表達(dá)，或抑癌基因表達(dá)的抑制可導(dǎo)致惡變發(fā)生。通常情況下，一個(gè)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞需要許多基因的改變，基因改變可以發(fā)生在不同層次。較常見(jiàn)的是突變:包括大規(guī)模的突變，涉及部分染色體的

3、缺失或增益;小規(guī)模的基因突變包括點(diǎn)突變、缺失、插入、可能發(fā)生在一個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，影響其表達(dá)，或可能發(fā)生在基因的編碼序列，并改變其蛋白產(chǎn)物的功能或穩(wěn)定。
　　 然而隨著研究的深入，大家逐漸認(rèn)識(shí)到腫瘤的發(fā)生發(fā)展遠(yuǎn)不止上述原因，國(guó)際權(quán)威雜志《Cell》撰文總結(jié)了腫瘤細(xì)胞的新十大特征，即:自給自足的生長(zhǎng)信號(hào);抗生長(zhǎng)信號(hào)的不敏感;回避凋亡;潛力無(wú)限的復(fù)制能力;持續(xù)的血管生成;組織浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移;避免免疫摧毀;促進(jìn)腫瘤的炎癥;細(xì)胞能量異常;

4、基因組不穩(wěn)定和突變。
　　 正因?yàn)榘┌Y是一類(lèi)疾病，將永遠(yuǎn)不可能像感染性疾病一樣用單一的治療方法治愈。血管生成抑制劑一度被認(rèn)為有潛力的“良方”可用于治療多種癌癥，但在臨床實(shí)踐中，情況并非如此。現(xiàn)在越來(lái)越多的癌癥研究以個(gè)體生物學(xué)為基礎(chǔ)，開(kāi)發(fā)適合不同個(gè)體藥物治療的個(gè)體化治療。癌癥研究是一個(gè)了解疾病的進(jìn)程并發(fā)現(xiàn)療法的過(guò)程。有關(guān)癌癥成因的研究主要集中在以下問(wèn)題上:引起或促進(jìn)細(xì)胞惡變過(guò)程中的遺傳物質(zhì)變化的事物（如病毒）和事件（如突變）;基因

5、損傷的機(jī)制，以及受其影響的下游基因;基因變化對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的影響，包括腫瘤細(xì)胞的生成及導(dǎo)致癌癥進(jìn)一步惡化的更多基因改變。通過(guò)對(duì)腫瘤的分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)認(rèn)識(shí)的提高，新的有效的治療方法會(huì)不斷涌現(xiàn)出來(lái)。
　　 靶向治療采用單抗、小分子物質(zhì)阻斷腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中特有信號(hào)傳導(dǎo)通路，達(dá)到治療腫瘤目的。胰島素樣生長(zhǎng)因子受體1(Insulinlikegrowthfactortype1，IGF-1R)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過(guò)多種機(jī)制涉及了腫瘤的發(fā)生、有

6、絲分裂、轉(zhuǎn)移、血管發(fā)生和抗凋亡等，并涉及了腫瘤化療的耐藥、放療以及針對(duì)HER-2和EGFR的靶向治療等方面。IGF-1R在許多腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，而抑制IGF-1R的表達(dá)不僅可以終止細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，還可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的惡變。目前針對(duì)IGF-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究，主要集中在IGF-1R及其下游，如IGF-1R單克隆抗體和酪氨酸激酶抑制劑。針對(duì)IGF-1R的單克隆抗體不僅可以阻斷配體-受體相互作用，還可以下調(diào)受體。受體的下調(diào)作用比阻斷配體-受體相互作

7、用在治療中的意義更重大目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)的針對(duì)IGF-1R的抗體主要包括IMC-A12，MK0646，AMG-479，AVE-1642以及CP-751871等，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均顯示出廣泛的抗腫瘤效果。2009年ASCO會(huì)議報(bào)道的CP-751871與紫杉醇化療方案聯(lián)合治療晚期轉(zhuǎn)移性NSCLC的Ⅱ期臨床試驗(yàn)的結(jié)果提示該藥與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用的前景。IGF-1R單克隆抗體CP-751871的Ⅱ期臨床研究的結(jié)果證實(shí)其對(duì)局部晚期和轉(zhuǎn)移性NSCLC

8、患者的一線治療的安全性和有效性，IGF-1R單克隆抗體可能會(huì)對(duì)NSCLC特別是肺鱗癌的治療提供一個(gè)新的治療選擇，現(xiàn)有的幾種靶向藥物對(duì)肺鱗癌患者治療效果不理想。然而，在隨后的CP-751871治療NSCLC的Ⅲ期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接受該藥物治療的NSCLC患者并不比只接受標(biāo)準(zhǔn)療法的患者活得更長(zhǎng)，因此該藥的臨床試驗(yàn)被迫終止。這使得我們有必要進(jìn)一步探究IGF-1R靶點(diǎn)的作用機(jī)制以及新的治療靶點(diǎn)與方法。
　　 本課題將深入研究IGF-1R信

9、號(hào)通路調(diào)控的關(guān)鍵因子，進(jìn)一步明確IGF-1R信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞中的作用，調(diào)控該信號(hào)通路的關(guān)鍵分子及其作用機(jī)制。另外，本課題還將研究IGF-1R抑制劑包括單克隆抗體與小分子抑制劑的作用機(jī)制，及改善抑制劑療效的藥物與方法。從而為靶向IGF-1R研究提供理論支持，為預(yù)測(cè)腫瘤靶向治療反應(yīng)提供分子標(biāo)記物，改善腫瘤靶向IGF-1R治療中存在的問(wèn)題。
　　 第一部分，G蛋白偶聯(lián)受體激酶的選擇性募集調(diào)控IGF-1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及受體轉(zhuǎn)運(yùn)
　　

10、 [研究目的]
　　 (1)明確G蛋白偶聯(lián)受體激酶(GRKs)在IGF-1R信號(hào)通路中的作用。
　　 (2)探討不同GRK介導(dǎo)不同IGF-1R下游信號(hào)通路的作用機(jī)制。
　　 [研究方法]
　　 (1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及RNA干擾技術(shù)分析蛋白之間的相互作用。
　　 (2)免疫共沉淀檢測(cè)蛋白相互結(jié)合情況。
　　 (3)SDS-PAGE及Western蛋白印跡分析蛋白表達(dá)。
　　 (4)激光共

11、聚焦顯微鏡直觀觀察蛋白分子之間的相互作用。
　　 (5)熒光共振能量轉(zhuǎn)移在活細(xì)胞實(shí)時(shí)檢測(cè)beta-arrestins同IGF-1R的結(jié)合情況。
　　 (6)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qReal-timePCR)技術(shù)檢測(cè)基因mRNA的表達(dá)情況。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)篩選-GRKs對(duì)IGF-1激活ERK/AKT信號(hào)通路的抑制作用。GRK2抑制IGF-1誘導(dǎo)的ERK活化，而GRK6可延長(zhǎng)ERK的活化。

12、　　 (2)驗(yàn)證:GRK2與GRK6影響IGF-1R表達(dá)。GRK2可使IGF-1R免于降解，而GRK6則加快IGF-1R的降解。
　　 (3)功能驗(yàn)證:IGF-1R是GRKs作用的底物。過(guò)表達(dá)GRK2后，HEK293T和BE細(xì)胞的IGF-1R絲氨酸磷酸化水平明顯升高;在過(guò)表達(dá)GRK6的HEK293T中，IGF-1R絲氨酸磷酸化在配體作用下也有升高，而在BE細(xì)胞中，無(wú)論是否受配體IGF-1的刺激，GRK6的過(guò)表達(dá)都明顯增加IGF

13、-1R的絲氨酸磷酸化。
　　 (4)β-arrestin1募集至IGF-1R受GRK調(diào)控。過(guò)表達(dá)GRK2可使β-arrestin1同IGF-1R的結(jié)合明顯增多，但解離快;但是，過(guò)表達(dá)GRK6可引起β-arrestin1/IGF-1R顯著而持續(xù)的結(jié)合。
　　 siRNA干擾GRK2后可顯著減少I(mǎi)GF-1R的泛素化，GRK2的過(guò)表達(dá)卻可明顯增加受體的泛素化;同樣，抑制GRK6也可減少受體泛素化，GRK6的高表達(dá)可增加受體基礎(chǔ)

14、泛素化水平。
　　 (5)確定GRK介導(dǎo)的磷酸化絲氨酸殘基位點(diǎn)。IGF-1RC端1248位絲氨酸(S1248)的磷酸化同GRK2過(guò)表達(dá)類(lèi)似，都可使IGF-1R/β-arrestin1短暫結(jié)合，促使ClassA受體反應(yīng)，而IGF-1RC端1291位絲氨酸(S1291)的磷酸化同GRK6過(guò)表達(dá)相似，可使IGF-1R/β-arrestin1穩(wěn)定結(jié)合，即ClassB受體反應(yīng)。
　　 (6)絲氨酸突變對(duì)受體降解的作用。S1248突

15、變引起的IGF-1R降解同GRK2表達(dá)量的變化類(lèi)似:S1248D（IGF-1RC端1248位絲氨酸突變?yōu)樘扉T(mén)冬氨酸）同GRK2過(guò)表達(dá)，S1248A（IGF-1RC端1248位絲氨酸突變?yōu)楸彼幔┩珿RK2低表達(dá)。同樣，S1291的突變模擬了GRK6的變化:S1291A等同于GRK6表達(dá)抑制，S1291D等同于GRK6過(guò)表達(dá)。
　　 [結(jié)論]
　　 GRKs可作用于IGF-1R的C端的絲氨酸殘基，不同的GRK催化不同位點(diǎn)的

16、絲氨酸磷酸化。GRK2的作用位點(diǎn)是IGF-1RC端的1248位的絲氨酸;GRK6的作用位點(diǎn)是IGF-1RC端的1291位的絲氨酸。不同位點(diǎn)絲氨酸的磷酸化可導(dǎo)致β-arrestin1不同的結(jié)合類(lèi)型，激活的下游信號(hào)通路也不盡相同:1248位絲氨酸的磷酸化可使β-arrestin1短暫結(jié)合，導(dǎo)致ERK的短暫活化，可使受體循環(huán)利用;而1291位絲氨酸的磷酸化可使ERK持續(xù)活化，導(dǎo)致受體的降解。上述GRKs在IGF-1R中的作用，同其在GPCR中

17、的作用類(lèi)似，從而使我們重新認(rèn)識(shí)IGF-1R，其不僅是酪氨酸激酶受體，同時(shí)可像GPCR一樣被GRK激活絲氨酸磷酸化，激活下游的信號(hào)通路。
　　 第二部分，IGF-1R抑制劑下調(diào)受體的分子機(jī)制研究
　　 第一節(jié)，IGF-1R人源化單克隆抗體的作用及其機(jī)制研究
　　 [研究目的]
　　 (1)探討IGF-1R單克隆抗體CP-751871是否引起受體下調(diào)，及明確其作用途徑。
　　 (2)探討CP-7518

18、71引起受體泛素化的作用機(jī)制。
　　 [研究方法]
　　 (1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及RNA干擾技術(shù)分析蛋白之間的相互作用。
　　 (2)免疫共沉淀檢測(cè)蛋白相互結(jié)合情況。
　　 (3)SDS-PAGE及Western蛋白印跡分析蛋白表達(dá)。
　　 (4)生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移在活細(xì)胞實(shí)時(shí)檢測(cè)IGF-1R泛素化的情況。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)IGF-1可激活I(lǐng)GF-1R下游信號(hào)及受體泛素化。I

19、GF-1可激活I(lǐng)GF-1R下游的信號(hào)通路，50ng/mlIGF-1刺激5min后可使ES1，RDES，LAP35與SKNMC細(xì)胞的IGF-1R，Akt及ERK蛋白磷酸化，而在受體陰性的SKBR3細(xì)胞未見(jiàn)上述蛋白的磷酸化。
　　 在ES1，RDES，LAP35及SKNMC細(xì)胞中，IGF-1R均有不同程度的泛素化，而在受體陰性的SKBR3細(xì)胞未檢測(cè)到泛素化。
　　 (2)CP-751871與IGF-1激活的信號(hào)通路的比較。C

20、P-751871同IGF-1激活的IGF-1R的下游信號(hào)通路存在很大差異:在ES1，RDES，LAP35與SKNMC細(xì)胞中IGF-1均可激活受體的酪氨酸磷酸化以及下游兩條重要信號(hào)通路蛋白Akt與ERK的磷酸化，而CP-751871僅能在ES1細(xì)胞中使ERK磷酸化。
　　 (3)CP-751871可使IGF-1R泛素化及降解。CP-751871比IGF-1對(duì)IGF-1R的降解作用更有效;IGF-1R可被IGF-1和CP-75187

21、1泛素化，但是，CP-751871作用更強(qiáng);在泛素化的細(xì)胞中可見(jiàn)β-arrestin1同IGF-1R不同程度的結(jié)合。
　　 (4)48位賴(lài)氨酸連接的泛素化在CP-751871介導(dǎo)的IGF-1R泛素化中發(fā)揮重要作用。ES1，LAP35與SKNMC細(xì)胞中，IGF-1可誘發(fā)48和63賴(lài)氨酸連接的受體泛素化，最大值在5到10mins。然而，CP-751871在LAP35細(xì)胞中，僅能引發(fā)48位賴(lài)氨酸連接的受體多泛素化。雖然其在ES1和SK

22、NMC細(xì)胞中，可誘發(fā)48和63位賴(lài)氨酸連接的受體多泛素化，但是63位賴(lài)氨酸連接的受體多泛素化較弱且消失較快。
　　 我們應(yīng)用BRET1檢測(cè)了IGF-1與CP-751871處理后β-arrestin1/IGF-1R結(jié)合情況。如圖5所示，ES1細(xì)胞中IGF-1刺激后可見(jiàn)β-arrestin1的結(jié)合，這同我們觀察到的其泛素化程度較SKNMC與LAP35細(xì)胞較高相一致;而CP-751871處理的細(xì)胞中，LAP35細(xì)胞的β-arresti

23、n1結(jié)合較多，這也同泛素化檢測(cè)結(jié)果相吻合。
　　 [結(jié)論]
　　 (1)IGF-1R的單抗CP-751871通過(guò)誘導(dǎo)其泛素化下調(diào)受體。
　　 (2)CP-751871介導(dǎo)的IGF-1R泛素化的主要類(lèi)型是48位賴(lài)氨酸連接的泛素化。
　　 (3)β-arrestin1參與了CP-751871引起的受體下調(diào)及泛素化。
　　 第二節(jié)，sunitinib泛素化下調(diào)IGF-1R的作用研究
　　 [研究

24、目的]
　　 探索sunitinib在IGF-1R細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用效應(yīng)，重點(diǎn)是在受體磷酸化和泛素化兩方面。
　　 [研究方法]
　　 (1)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化及細(xì)胞凋亡情況。
　　 (2)SDS-PAGE及Western蛋白印跡分析蛋白表達(dá)。
　　 (3)MTT法分析細(xì)胞增殖與藥物毒性。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)IGF-1激活I(lǐng)GF-1R信號(hào)通路，可引起明顯的I

25、GF-1R、Akt和ERK的磷酸化;然而，IGF-1R、Akt和ERK的磷酸化受到sunitinib顯著的抑制。
　　 (2)sunitinib可以顯著下調(diào)IGF-1R的表達(dá)，引起受體泛素化。HEK293細(xì)胞系無(wú)血清培養(yǎng)24h后應(yīng)用100ng/mlIGF-1或者10nMsunitinib處理10min，與對(duì)照組（只有無(wú)血清培養(yǎng)，無(wú)其他相關(guān)試劑處理）相比，IGF-1和sunitinib可以顯著引起受體泛素化，提示IGF-1和sun

26、itinib通過(guò)泛素依賴(lài)蛋白酶體通路增加受體降解，從而下調(diào)受體表達(dá)。
　　 (3)在sunitinib刺激下，MDM2可以結(jié)合IGF-1R。分別應(yīng)用HA-MDM2高表達(dá)MDM2(+MDM2)和siRNA沉默MDM2(-MDM2)，無(wú)血清培養(yǎng)HEK293細(xì)胞24h后應(yīng)用10nMsunitinib處理10min。與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)MDM2細(xì)胞系IGF-1R受體泛素化程度增加，而在MDM2缺失表達(dá)細(xì)胞系中并未發(fā)現(xiàn)受體泛素化現(xiàn)象。這些

27、結(jié)果顯示sunitinib可引起IGF-1R泛素化，該泛素化依賴(lài)MDM2。
　　 [結(jié)論]
　　 sunitinib可阻斷IGF-1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并且介導(dǎo)其降解，而降解依賴(lài)于MDM2介導(dǎo)的泛素化作用。
　　 第三部分，p53-MDM2信號(hào)通路同IGF-1R信號(hào)通路的關(guān)系研究
　　 [研究目的]
　　 (1)明確p53野生/突變型對(duì)IGF-1R單克隆抗體CP-751871敏感性的影響。
　　 (

28、2)明確p53野生/突變型在nutlin-3a增敏紫杉醇中的作用。
　　 [研究方法]
　　 (1)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化及細(xì)胞凋亡情況。
　　 (2)SDS-PAGE及Western蛋白印跡分析蛋白表達(dá)。
　　 (3)AlamarBlue及MTT法分析細(xì)胞增殖與藥物毒性。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)我們應(yīng)用AlamarBlue檢測(cè)了p53基因型不同的ES1，RDES，LAP35與S

29、KNMC細(xì)胞系對(duì)CP-751871的敏感性。發(fā)現(xiàn)野生型p53的LAP35細(xì)胞對(duì)CP-751871最敏感，而p53缺失的SKNMC細(xì)胞最耐受。而且我們應(yīng)用MDM的拮抗劑Nutlin-3a處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，僅在LAP35細(xì)胞中Nutlin-3a同CP-751871具有協(xié)同作用，可提高CP-751871的療效約20％。
　　 (2)Nutlin-3a可保護(hù)野生型p53細(xì)胞免受紫杉醇的細(xì)胞毒作用，但卻對(duì)p53缺失的H1299細(xì)胞無(wú)作用。細(xì)

30、胞增殖實(shí)驗(yàn)也表明，Nutlin-3a可減低野生型p53細(xì)胞對(duì)紫杉醇細(xì)胞毒作用的敏感性，但卻對(duì)p53缺失的H1299細(xì)胞無(wú)影響。
　　 [結(jié)論]
　　 (1)表達(dá)野生型p53的細(xì)胞對(duì)IGF-1R單克隆抗體CP-751871更敏感。
　　 (2)Nutlin-3a介導(dǎo)的紫杉醇的細(xì)胞毒作用，依賴(lài)于p53的狀態(tài)。對(duì)于野生型的p53細(xì)胞，Nutlin-3a降低了分裂期細(xì)胞毒化療藥物的敏感性。在選擇化療輔助藥物時(shí)應(yīng)足夠謹(jǐn)慎，