葉下珠復(fù)方Ⅱ號對肝癌細(xì)胞IGF-1R信號通路活化的抑制作用研究.pdf

1、目的:
　　探討葉下珠復(fù)方Ⅱ號通過抑制IGF-1R信號通路活化從而發(fā)揮抗肝癌作用的新機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.IGF-1R表達(dá)抑制肝癌Huh7細(xì)胞株建立
　　采用siRNA基因沉默技術(shù)，依據(jù)siRNA靶序列設(shè)計(jì)原則，針對Huh7細(xì)胞IGF-1R序列，設(shè)計(jì)并合成三對核苷酸干擾序列，克隆入慢病毒pLVX-shRNA1載體，對shRNA表達(dá)的重組質(zhì)粒提取、酶切鑒定，證實(shí)其序列與設(shè)計(jì)序列完

2、全一致。提取純化高質(zhì)量的重組質(zhì)粒，使用高效重組載體和病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝，收集病毒液，濃縮，純化病毒液。用病毒感染Huh7細(xì)胞，經(jīng)篩選后獲得穩(wěn)定感染的細(xì)胞株。通過Western blot法檢測anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞（I1和I2）、Huh7-NC細(xì)胞和Huh7細(xì)胞中IGF-1R基因和蛋白表達(dá)的差異。
　　2.葉下珠復(fù)方Ⅱ號對Huh7細(xì)胞和anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞增殖的影響
　　

3、采用MTT法檢測不同濃度葉下珠復(fù)方Ⅱ號作用48h對Huh7細(xì)胞、anti-IGF-1RHuh7細(xì)胞增殖的抑制作用效果，并計(jì)算出藥物半數(shù)抑制濃度;設(shè)置對照組、葉下珠復(fù)方Ⅱ號高劑量組(3.0mg/ml)、低劑量組(1.5mg/ml)、5-FU組(30μg/ml)，每組4個復(fù)孔，檢測藥物作用于Huh7細(xì)胞及anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞24h、48h的抑制作用效果。
　　3.葉下珠復(fù)方Ⅱ號對Huh7細(xì)胞和anti-IGF-1R H

4、uh7細(xì)胞凋亡的影響
　　設(shè)置細(xì)胞對照組、葉下珠復(fù)方Ⅱ號高劑量組(3.0mg/ml)、低劑量組(1.5mg/ml)、5-FU組(30μg/ml)，每組3個復(fù)孔。葉下珠復(fù)方Ⅱ號作用于Huh7細(xì)胞及anti-IGF-1RHuh7細(xì)胞48h后，采用流式細(xì)胞儀AnnexinⅤ-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡率。
　　4.葉下珠復(fù)方Ⅱ號對Huh7細(xì)胞和anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞基因表達(dá)的影響
　　設(shè)置細(xì)胞對照組、葉下珠復(fù)

5、方Ⅱ號高劑量組(3.0mg/ml)、低劑量組(1.5mg/ml)、5-FU組(30μg/ml)，每組3個復(fù)孔。葉下珠復(fù)方Ⅱ號作用于Huh7細(xì)胞及anti-IGF-1RHuh7細(xì)胞48h后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測葉下珠復(fù)方Ⅱ號對Huh7細(xì)胞及anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞中IGF-1R信號通路基因表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.與Huh7細(xì)胞組比較，Huh7-NC、I1、I2細(xì)胞組中IGF-1R的表達(dá)明顯降低(

6、P＜0.05)，其中I1細(xì)胞組中IGF-1R的表達(dá)最低，故選取I1細(xì)胞作為穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，即anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞株構(gòu)建成功。
　　2.葉下珠復(fù)方Ⅱ號作用于Huh7細(xì)胞48h的半數(shù)抑制濃度為3.019mg/ml，作用于antj-IGF-1R Huh7細(xì)胞48h的半數(shù)抑制濃度為1.641mg/ml。
　　葉下珠復(fù)方Ⅱ號對Huh7細(xì)胞和anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用（P＜0.05），且隨劑

7、量增加，抑制效果越明顯。葉下珠復(fù)方Ⅱ號作用24h后，對anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞的抑制作用比Huh7細(xì)胞更明顯（P＜0.05）;葉下珠復(fù)方Ⅱ號作用48h后，對anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞的抑制作用比Huh7細(xì)胞更強(qiáng)，差異具有顯著性意義(P＜0.05)。
　　3.葉下珠復(fù)方Ⅱ號作用于Huh7細(xì)胞48h后，細(xì)胞早期凋亡率對比對照組顯著升高（P＜0.05），說明葉下珠復(fù)方Ⅱ號對Huh7細(xì)胞有誘導(dǎo)其早期凋亡的作用。

8、>　　4.葉下珠復(fù)方Ⅱ號作用于Huh7細(xì)胞和anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞48h后，Huh7細(xì)胞中IGF-1R及PI3K、AKT3、N-RAS、K-RAS、C-RAF和ERK1基因的mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05);anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞中IGF-1R及PI3K、AKT3、N-RAG、K-RAG、C-RAF和ERK1等基因的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。與Huh7細(xì)胞相比，葉下珠復(fù)方Ⅱ治療后anti-IGF-1R