半乳凝素-1敲低通過抑制RaF-1-AP-1信號通路提高乳腺癌的藥物敏感性.pdf

1、目的：
　　半乳凝素-1(Gal-1)，半乳凝素家族的碳水化合物結(jié)合蛋白的成員，在腫瘤發(fā)生的各種細(xì)胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Gal-1對多藥耐藥(MDR)乳腺癌細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用仍不清楚。
　　本課題包括以下三部分:第一部分:Gal-1和MDR1在乳腺腫瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá);第二部分:Gal-1敲低對乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/PTX和MCF-7/ADR中PTX和ADR的敏感性的影響;第三部分:Gal-1敲低增強(qiáng)乳腺癌耐藥細(xì)胞系M

2、CF-7/PTX和MCF-7/ADR對PTX和ADR的敏感性的機(jī)制。
　　第一部分 Gal-1和MDR1在乳腺腫瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)
　　方法：
　　1.通過real-time PCR的方法分別檢測乳腺癌腫瘤組織以及正常組織中Gal-1和MDR1的mRNA表達(dá)水平。
　　2.通過real-time PCR分析檢測人乳腺上皮細(xì)胞系（MCF-10A）和乳腺癌細(xì)胞系人乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7)以及其對應(yīng)的耐藥株MCF

3、-7/ADR和MCF-7/PTX中Gal-1和MDR1的mRNA表達(dá)水平。
　　3.通過western blot分析的方法檢測人乳腺上皮細(xì)胞系(MCF-10A)和乳腺癌細(xì)胞系人乳腺癌細(xì)胞系（MCF-7）以及其對應(yīng)的耐藥株MCF-7/ADR和MCF-7/PTX中Gal-1和P-糖蛋白（P-gp）的蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.與正常組織相比，乳腺癌腫瘤組織中Gal-1和MDR1的mRNA表達(dá)水平均出現(xiàn)上調(diào)，而且二

4、者的表達(dá)呈正相關(guān)。
　　2.與人乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A相比，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中Gal-1和MDR1的mRNA表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著上調(diào)，此外，與乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的親本株相比，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的耐藥株MCF-7/ADR和MCF-7/PTX中Gal-1和MDR1的mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步增加。
　　3.與人乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A相比，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中Gal-1和P-糖蛋白(P-gp)的蛋白表達(dá)水平

5、均出現(xiàn)顯著增加，此外，與乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的親本株相比，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的耐藥株MCF-7/ADR和MCF-7/PTX中Gal-1和P-糖蛋白(P-gp)的蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步增加。
　　第二部分 Gal-1敲低對乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/PTX和MCF-7/ADR中PTX和ADR的敏感性的影響
　　方法：
　　1.通過MTT實(shí)驗(yàn)的方法檢測乳腺癌細(xì)胞系MCF-7以及其耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR和MCF-7/

6、PTX細(xì)胞的存活率。
　　2.通過westernblot的方法檢測Gal-1在轉(zhuǎn)染siRNA-Gal-1和siRNA-Gal-2的ADR和PTX耐受的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADR和MCF-7/PTX中的表達(dá)。
　　3.通過MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)檢測Gal-1敲低對ADR和PTX耐受的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADR和MCF-7/PTX細(xì)胞活性的影響。
　　4.通過流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法檢測Gal-1敲低對ADR和PTX耐受的

7、乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADR和MCF-7/PTX細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　1.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的親本株相比，ADR和PTX耐受的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADR和MCF-7/PTX的細(xì)胞活性顯著增加。
　　2.Western blot結(jié)果證實(shí)，與Con siRNA對照組相比，Gal-1在轉(zhuǎn)染siRNA-Gal-1和siRNA-Gal-2的ADR和PTX耐受的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/A

8、DR和MCF-7/PTX中中出現(xiàn)低表達(dá)。
　　3.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Gal-1敲低或(PTX或ADR)處理導(dǎo)致細(xì)胞活力的明顯降低;此外，與單獨(dú)化療組相比，在MCF-7/PTX和MCF-7/ADR細(xì)胞中，Gal-1敲低與PTX或ADR的組合導(dǎo)致更低的細(xì)胞活力。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Gal-1敲低或(PTX或ADR)處理導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的顯著增加;此外，與單獨(dú)化療組相比，在MCF-7/PTX和MCF-7/ADR細(xì)胞中，

9、Gal-1敲低與PTX或ADR的組合誘導(dǎo)更高的細(xì)胞凋亡。
　　第三部分 Gal-1敲低增強(qiáng)乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/PTX和MCF-7/ADR對PTX和ADR的敏感性的機(jī)制
　　方法：
　　1.利用Western blot分析的方法檢測轉(zhuǎn)染siRNA-Gal-1和pcDNA-MDR1的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/PTX和MCF-7/ADR中P-gp蛋白的表達(dá)。
　　2.通過MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)檢測Gal-1敲低或MD

10、R1過表達(dá)對ADR和PTX耐受的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADR和MCF-7/PTX細(xì)胞活性的影響。
　　3.通過流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法檢測Gal-1敲低或MDR1過表達(dá)對ADR和PTX耐受的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADR和MCF-7/PTX細(xì)胞凋亡的影響。
　　4.通過westernblot分析確定siRNA-Gal-1和siRNA-Gal-2對ADR和PTX耐受的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADR和MCF-7/PTX中Raf-1

11、/AP-1信號通路相關(guān)蛋白p-Raf-1(Ser338)，Raf-1，p-c-Jun(Ser73)，c-Jun和c-Fos的表達(dá)的影響。
　　5.通過westernblot分析確定Raf-1siRNAs和Raf-1抑制劑GW5074對ADR和PTX耐受的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADR和MCF-7/PTX中Raf-1/AP-1信號通路相關(guān)蛋白以及P-gp蛋白表達(dá)的影響。
　　6.通過MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)檢測Raf-1siRNA1

12、(GW5074)或Raf-1siRNA1(GW5074)+pcDNA-MDR1處理對PTX和ADR耐受的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/PTX和MCF-7/ADR細(xì)胞活性的影響。
　　7.通過流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法檢測Raf-1siRNA1(GW5074)或Raf-1siRNA1(GW5074)+pcDNA-MDR1處理對PTX和ADR耐受的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/PTX和MCF-7/ADR細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　1.

13、Western blot分析表明，與相應(yīng)的對照組相比，Gal-1siRNA1和Gal-1siRNA2均顯著降低MCF-7/PTX和MCF-7/ADR細(xì)胞中P-gp的水平，而過表達(dá)MDR1則減輕了Gal-1siRNA1或Gal-1siRNA2對P-gp的抑制作用。
　　2.MTT測定顯示，與（Con siRNA+藥物）組相比，Gal-1siRNA1和PTX或Gal-1siRNA1和ADR的組合顯著抑制MCF-7/PTX和MCF-7/

14、ADR細(xì)胞的相對細(xì)胞活力，過表達(dá)MDR1逆轉(zhuǎn)Gal-1敲低對MCF-7/PTX和MCF-7/ADR細(xì)胞活性的抑制作用。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與（Con siRNA+藥物）組相比，Gal-1siRNA1和PTX或Gal-1siRNA1和ADR的組合顯著促進(jìn)MCF-7/PTX和MCF-7/ADR細(xì)胞的凋亡，過表達(dá)MDR1逆轉(zhuǎn)Gal-1敲低對MCF-7/PTX和MCF-7/ADR細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。
　　4.West

15、ernblot分析表明，與ConsiRNA組相比，Gal-1siRNA1和Gal-1siRNA2顯著降低了MCF-7/PTX和MCF-7/ADR細(xì)胞中p-Raf-1(Ser338)，p-c-Jun(Ser73)，c-Jun及c-Fos的表達(dá)水平。
　　5.Western blot分析表明，與對照組相比，Raf-1siRNA1和Raf-1siRNA2顯著降低了P-gp，p-Raf-1(Ser338)，Raf-1，p-c-Jun(Se

16、r73)，c-Jun和c-Fos在MCF-7/PTX細(xì)胞中的表達(dá)。此外，Raf-1抑制劑GW5074顯著降低MCF-7/ADR細(xì)胞中P-gp，p-Raf-1(Ser338)，p-c-Jun(Ser73)，c-Jun和c-Fos的水平。
　　6.MTT測定顯示，與（ConsiRNA+藥物）組相比，Raf-1siRNA1和PTX或GW5074和ADR的組合顯著抑制MCF-7/PTX和MCF-7/ADR細(xì)胞的相對細(xì)胞活力，過表達(dá)MDR1

17、逆轉(zhuǎn)Gal-1敲低對MCF-7/PTX和MCF-7/ADR細(xì)胞活性的抑制作用。
　　7.流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與（ConsiRNA+藥物）組相比，Raf-1siRNA1和PTX或GW5074和ADR的組合顯著促進(jìn)MCF-7/PTX和MCF-7/ADR細(xì)胞的凋亡，過表達(dá)MDR1逆轉(zhuǎn)Gal-1敲低對MCF-7/PTX和MCF-7/ADR細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。
　　結(jié)論：
　　1.Gal-1和MDR1在乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)