基于大鼠睪丸細胞三維共培養(yǎng)模型的雄性生殖毒性測試系統(tǒng)建立.pdf

1、目的：
　　生殖和發(fā)育功能障礙是當前嚴重影響人體健康的主要公共衛(wèi)生問題之一。現(xiàn)行各類化合物的生殖毒性評價主要采用整體動物試驗方法，但以整體動物為基礎(chǔ)的生殖毒性測試評價方法不符合“3R”原則，不能完全滿足安全性或危險性評價發(fā)展的需求。建立更好地吸收融合現(xiàn)代生物技術(shù)、能提供更多機制信息、能轉(zhuǎn)化應用于人體的體外毒性測試評價方法成為發(fā)展趨勢。睪丸是外源性化合物雄性生殖毒性最敏感的器官，雄性生殖的主要功能精子發(fā)生和性激素的生成也由睪丸完成。

2、因此，睪丸成為建立雄性生殖毒性體外測試方法時優(yōu)先考慮的器官。目前國內(nèi)外已建立了多種睪丸細胞體外毒性測試方法，存在的主要問題包括，單個細胞的試驗只能對該細胞的特異毒性及其機制進行研究，難以作為睪丸毒性的評價方法;尚不能觀察對生精細胞分化即精子生成的影響。因此，建立能涵蓋睪丸主要細胞Sertoli細胞、Leydig細胞和生精細胞功能，特別是能觀察生精細胞分化的研究模型成為近年來研究努力的方向。
　　近年來，在睪丸細胞生物學領(lǐng)域取得兩項

3、重要進展，一是用細胞外基質(zhì)作為支架成功實現(xiàn)了能更好維持睪丸主要體細胞功能的三維短期共培養(yǎng);二是發(fā)現(xiàn)血清替代物(knockOut serum replacement，KSR)能夠促進胚胎干細胞和精原細胞的增殖及精原細胞向初級精母細胞分化。基于此，我們推測如將兩項成果加以綜合，加之培養(yǎng)條件的優(yōu)化，有可能建立穩(wěn)定的既能觀察睪丸主要體細胞功能，又能觀察生精細胞分化功能的研究模型。本研究的思路是擬采用細胞外基質(zhì)作為3D培養(yǎng)支架，以KSR作為血清替

4、代物，對睪丸Sertoli細胞、Leydig細胞和生精細胞進行共培養(yǎng);再通過選擇比較不同的培養(yǎng)方式、延長培養(yǎng)時間、優(yōu)化培養(yǎng)條件，建立既能觀察Sertoli細胞和Leydig細胞功能變化，又可以觀察精原細胞分化的大鼠睪丸細胞三維共培養(yǎng)模型;然后研究其作為睪丸體外毒性測試系統(tǒng)的適用性。目的是為建立既可作為評價各類化學物對大鼠睪丸主要體細胞功能影響，還可觀察對精子發(fā)生影響、能提供更多毒作用機制信息的大鼠睪丸體外毒性測試系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。
　

5、　方法：
　　1、大鼠睪丸細胞3D共培養(yǎng)模型的建立:選擇6日齡SD大鼠，處死取出睪丸，清洗去白膜，經(jīng)過系列酶消化獲得細胞懸浮液，經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾，用臺盼藍鑒定存活率，以原比例混合共培養(yǎng)方式在37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。獲取細胞當天為d0。采用細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)作為三維支架，KSR作為常規(guī)胎牛血清FBS的替代物，以細胞增殖能力、睪酮含量、乳酸鹽分泌量和生精細胞減數(shù)分裂特異性基因St

6、ra8和Sycp3作為該模型初步成功與否的判斷指標。通過對不同濃度的ECM和HCG、不同密度的細胞、不同日齡的乳鼠，不同時長的共培養(yǎng)周期的比較確定適宜的實驗條件。為評價共培養(yǎng)模型的效果，與采用常規(guī)胎牛血清的3D共培養(yǎng)方式(FBS+ECM)和未采用ECM的2D共培養(yǎng)方式(KSR-ECM)進行比較。
　　2、大鼠睪丸細胞3D共培養(yǎng)模型作為雄性生殖毒性測試系統(tǒng)適用性的初步驗證:選用歐洲替代方法驗證中心推薦的雙酚A(BiphoneA，BP

7、A)和鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl Phthalate，DBP)作為陽性物，觀察不同作用時間（8、16和24天）和暴露濃度（BPA:0、17.85、37.5和75μM; DBP:0、6.25、12.5和25μM）驗證該模型作為毒性測試系統(tǒng)的可行性。
　　3、新藥HZ1006長期毒性研究和基于大鼠睪丸細胞3D共培養(yǎng)模型的睪丸毒性研究:對新藥(代號為HZ1006)進行SD大鼠和Beagle犬的28天長期毒性試驗，大鼠:20、60和

8、120 mg/kg，犬:20、40和80 mg/kg，經(jīng)口給藥，連續(xù)28天，恢復期大鼠2周，犬4周。選擇HZ1006不同暴露時間（8、16和24天）和暴露濃度（0、3.125、6.25、12.5和25μM），采用所建測試系統(tǒng)對HZ1006潛在的體外雄性生殖毒性及其作用機制進行應用研究。
　　結(jié)果：
　　1、大鼠睪丸細胞3D共培養(yǎng)模型的建立:結(jié)果顯示睪丸細胞分離存活率在95％以上，三種主要細胞維持了良好的生長增殖情況，從乳酸鹽

9、、睪酮分泌量和生精細胞分化情況來看，睪酮和乳酸鹽分泌量30天穩(wěn)定，生精細胞d24-d26期間內(nèi)開始檢測到了減數(shù)分裂特異標志，顯示培養(yǎng)物在共培養(yǎng)期間三種主要細胞不僅生長良好，而且保持了良好的細胞功能。培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果顯示200μg/ml的細胞外基質(zhì)濃度、5×105/ml的細胞密度、10 IU/ml HCG，出生后6天的乳鼠和26天的培養(yǎng)周期被確定為適宜的實驗條件。與FBS+ECM的3D共培養(yǎng)和KSR-ECM的2D共培養(yǎng)方式比較結(jié)果顯示，本

10、試驗培養(yǎng)方式的細胞增殖能力增強，細胞生長良好，細胞之間形成緊密連接;睪酮和乳酸鹽分泌量明顯提高且分泌較為穩(wěn)定;在d24-d26期間開始檢測到了生精細胞第一次減數(shù)分裂特異標志（Sycp3和Stra8基因和蛋白）。
　　2、大鼠睪丸細胞3D共培養(yǎng)模型作為雄性生殖毒性測試系統(tǒng)適用性的初步驗證:結(jié)果顯示BPA和DBP可抑制睪酮的分泌，BPA和DBP對睪酮分泌量的影響具有明顯的時間和劑量依賴性。不同濃度BPA和DBP對類固醇激素合成相關(guān)基因

11、Star的表達水平也有明顯影響，隨著濃度增加Star基因和蛋白表達量下降，有明顯的劑量-效應趨勢。BPA和DBP可使乳酸鹽分泌量下降，對乳酸鹽分泌量的影響具有明顯的時間和劑量依賴性。不同濃度的BPA和DBP對雄激素轉(zhuǎn)運蛋白基因(Abp)的基因和蛋白表達水平有明顯影響，隨著濃度增加Abp表達量下降，有明顯的劑量-效應趨勢。不同濃度BPA和DBP作用24天后，可對生精細胞減數(shù)分裂特異性基因Stra8和Sycp3的表達造成不同程度的影響，對S

12、tra8和Sycp3基因和蛋白表達的抑制作用有明顯的劑量-效應趨勢。結(jié)果還顯示，BPA最敏感的靶細胞是Sertoli細胞，可能首先引起Sertoli細胞功能改變，而DBP最敏感的靶細胞是Leydig細胞，可能首先引起Leydig細胞功能改變，進而影響其他生殖細胞功能。
　　3、新藥HZ1006長期毒性研究和基于大鼠睪丸細胞3D共培養(yǎng)模型的睪丸毒性研究:40mg/kg以上劑量的HZ1006可引起犬雄性生殖毒性，表現(xiàn)為睪丸、附睪和前列

13、腺的病理改變。其中睪丸的病理改變包括生精小管管腔偏小，數(shù)量也較少，生精細胞層次單一，數(shù)量明顯減少，只能見到精原細胞和部分初級精母細胞，次級精母細胞、各級精細胞、成熟精子罕見。但大鼠未觀察到明顯的雄性生殖毒性。體外實驗結(jié)果顯示，HZ1006對共培養(yǎng)細胞24 h、48 h和72 h的細胞毒性(IC50)分別為325.19、277.17和149.64μM。HZ1006抑制細胞增殖，對細胞增殖能力的影響有一定時間和劑量依賴性。HZ1006可抑制

14、睪酮的分泌，對睪酮分泌量的影響具有明顯的時間和劑量依賴性。不同濃度HZ1006作用24天后，可對生精細胞減數(shù)分裂特異性基因Stra8和Sycp3的表達造成不同程度的影響，對Stra8和Sycp3基因和蛋白表達的抑制作用有明顯的劑量-效應趨勢。試驗還觀察到HZ1006可致AR蛋白水平及其靶向基因PSA表達水平的下降，Hdac6表達下降。
　　結(jié)論：
　　1、成功建立了既能觀察Sertoli細胞和Leydig細胞功能變化，又可以

15、觀察生精細胞增殖分化，可作為研究大鼠睪丸主要細胞生物學功能的3D體外共培養(yǎng)模型。目前國內(nèi)外尚未報道。
　　2、驗證結(jié)果顯示大鼠睪丸細胞3D共培養(yǎng)模型可有效檢測出BPA和DBP對雄性睪丸細胞已知的各類毒作用，并可更準確地確定靶細胞等，為機制研究提供更多信息。初步表明該模型可作為雄性生殖毒性的測試系統(tǒng)及其毒作用機制的研究模型。
　　3、新藥HZ1006在40mg/kg以上劑量經(jīng)口給藥可引起犬雄性生殖毒性，表現(xiàn)為睪丸、附睪和前列腺

16、的病理改變。但對大鼠未觀察到明顯的雄性生殖毒性。HZ1006在體外可導致睪丸毒性，這與長期毒性試驗中HZ1006犬睪丸毒性結(jié)果是一致的，其作用靶細胞可能是Leydig細胞，由于影響睪酮分泌，進而影響精子生成。初步的機制研究提示HZ1006引起的生殖毒性改變可能與其對Hdac6的抑制作用有關(guān)，表現(xiàn)為AR蛋白水平的降低及其靶向基因水平的下降。研究結(jié)果為HZ1006的毒性評價和機制研究提供了新的實驗依據(jù);也證實了所建模型作為雄性生殖毒性測試系