內(nèi)皮祖細胞三維血管新生模型的建立及其特性分析.pdf

1、目的：隨著血管組織工程技術的不斷完善，內(nèi)皮祖細胞在組織工程中的應用也引起了研究者的重視?，F(xiàn)階段應用于臨床的組織工程材料包括異體血管、人工合成材料和自體血管。異體血管移植存在嚴重的免疫反應；人工血管生物相容性較好，免疫反應低，但是缺乏內(nèi)膜，容易發(fā)生血栓，尤其是小口徑血管(<6 mm)移植失敗率高；自體血管則受到血管功能條件限制，往往不能滿足移植需求。而實驗證明內(nèi)皮祖細胞能參與新生血管的形成，具有高增殖能力以及和成熟血管內(nèi)皮細胞有著相似的特

2、性，而且取材方便，因此是組織工程血管、血管移植物再內(nèi)皮化以及構建組織工程器官血管網(wǎng)絡種子細胞的理想來源。但目前對內(nèi)皮祖細胞的定性、分化及發(fā)育機制仍不清楚，而且平面培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細胞雖然能形成類似毛細血管樣結構，但其不符合體內(nèi)的生長環(huán)境，其生物學特性在人體內(nèi)也有很大差異。近年來三維基質(zhì)的發(fā)現(xiàn)及其在骨細胞、內(nèi)皮細胞培養(yǎng)等方面的應用解決了這一難題。 基于此，設計了本試驗來觀察大鼠外周血及骨髓內(nèi)皮祖細胞的體外培養(yǎng)和擴增，對培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細胞

3、進行表面標記和功能檢測，同時建立三維立體模型，立體觀察內(nèi)皮祖細胞在血管新生中的作用，同時對模型進行分析進一步了解細胞培養(yǎng)后有何生物學作用，并與平面培養(yǎng)相比較，為內(nèi)皮祖細胞在血管新生及組織工程中的廣泛應用提供試驗性理論基礎。 方法： 1．分別取大鼠外周血和骨髓，加M199等倍稀釋并混勻。沿管壁緩慢加入裝有Ficoll分離液(1.073g/ml)的50m1離心管中。2000r/min×30 min密度梯度離心后將中間的白霧層

4、吸出并置入另一短中管中，加入5倍以上體積的M199，以1300 r/min離心5 min，洗滌細胞兩次。末次離心后，棄上清，加入M199重懸細胞。取1滴細胞懸液與1滴2.0g/L臺盼藍染液混合，滴于血球計數(shù)板上，計數(shù)4個大方格內(nèi)細胞的總數(shù)。以1×106/L的密度接種于加有M199完全培養(yǎng)液的預涂纖連蛋白的培養(yǎng)皿中，置37℃、50％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d后換液，將未貼壁細胞棄之。此后每隔3 d更換培養(yǎng)液，細胞飽和后用胰酶消化備

5、用。 2．冰上將膠原液4ml與0.5ml10×M199培養(yǎng)液、0.5ml1mol/LNaOH在10ml試管中混勻，將之加入24孔培養(yǎng)板上，每孔加入0.3ml。置入37℃、50％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，待凝固后取出，表面分別加入上述從外周血和骨髓中消化下來的細胞并補足完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)于培養(yǎng)箱中，待細胞融合至70％-80％時添加另一層膠原，對照組培養(yǎng)液中不含VEGF。 3．觀察因子誘導下三維模型的新生芽數(shù)變化并對三維模型進行

6、鑒定。 結果： 1．骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞在數(shù)量及生長速度上均大于外周血來源，二者均表達Ⅷ因子和CD133。CD133在第七天左右表達高峰，隨后表達逐漸消弱，Ⅷ因子表達率逐漸增高。證明了所培養(yǎng)細胞為內(nèi)皮祖細胞。 2．內(nèi)皮祖細胞在以Ⅰ型膠原為主的三維基質(zhì)內(nèi)分別從上、下兩個方向向膠原基質(zhì)內(nèi)生長，24 h內(nèi)即可出現(xiàn)向膠原內(nèi)的出芽及浸潤。隨著時間的推移，逐漸形成垂直于膠原基底面的分支樣結構，并相互交織成網(wǎng)。對照組細胞生長慢

7、，出芽慢，管狀結構細小，向膠原內(nèi)浸潤的深度淺，網(wǎng)狀結構稀疏，不完整。血管數(shù)在第9天前逐漸增加，隨后未見增加并出現(xiàn)部分萎縮。 3．VEGF實驗組與對照組新生血管數(shù)目對比有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)，VEGF能動員和誘導內(nèi)皮祖細胞促進血管新生。 結論： 1．骨髓來源內(nèi)皮祖細胞在數(shù)量及分化生長速度上均大于外周血來源的內(nèi)皮祖細胞，功能上均表達CD133和Ⅷ因子，形態(tài)上無明顯差異。 2．鼠尾膠原凝膠可以為內(nèi)皮祖