血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及其生化、細(xì)胞學(xué)特性分析.pdf

1、血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及其生化、細(xì)胞學(xué)特性分析背景：血管瘤是一種小兒常見(jiàn)的良性腫瘤，屬先天性疾患，為毛細(xì)血管擴(kuò)張?jiān)錾?、血管?nèi)皮細(xì)胞增生及血管畸形所致。血管瘤雖然是良性瘤，呈浸潤(rùn)性，且繼續(xù)不斷生長(zhǎng)，范圍較廣，故它影響人體的解剖結(jié)構(gòu)和生理功能，造成畸形及容貌缺陷，而對(duì)正常組織往往破壞性較大，有的甚至?xí){生命。但由于對(duì)其組織發(fā)生、分化及生物學(xué)行為的研究甚少，對(duì)其發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，目前尚無(wú)有效治療措施。 通過(guò)對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及

2、生化生物學(xué)分析，對(duì)血管瘤的發(fā)生、形成條件、消退機(jī)制等會(huì)有更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，從而為治療提供合理方案、發(fā)現(xiàn)更好的治療藥物、改善血管瘤臨床治療的現(xiàn)狀；同時(shí)血管瘤為研究血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管發(fā)生的信號(hào)機(jī)制提供了寶貴的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，可為研究血管發(fā)育提供有益的線索。 目的：本課題旨在掌握血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律，研究血管瘤及其內(nèi)皮細(xì)胞與正常成人血管及其內(nèi)皮細(xì)胞在組織結(jié)構(gòu)、生化及生物學(xué)特征、培養(yǎng)方法、生長(zhǎng)曲線等方面有何異同，其中包括第Ⅷ凝血因子相關(guān)

3、抗原和P53蛋白的存在和表達(dá)情況，為血管瘤的臨床治療提供理論依據(jù)。 方法：本課題用常規(guī)組織切片技術(shù)和染色方法制作血管瘤、正常成人血管及臍靜脈的石蠟組織切片；用間接免疫熒光法和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察第Ⅷ凝血因子相關(guān)抗原在其內(nèi)的表達(dá)情況；用免疫組化法和共聚焦顯微鏡觀察分析血管瘤細(xì)胞中熒光標(biāo)記的P53蛋白的表達(dá)情況、對(duì)比不同標(biāo)本的差異。以新鮮血管瘤為材料，用0.1％的胰酶消化血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，用添加了成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)的含1

4、0％小牛血清的M199培養(yǎng)液在含5％CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔兩天換液，待長(zhǎng)成單層細(xì)胞以后傳代，建立血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞系，觀察其生長(zhǎng)、增殖特征。通過(guò)以上試驗(yàn)對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生化及生物學(xué)特征進(jìn)行分析。 結(jié)果：將皮膚血管瘤組織制成石蠟組織切片后進(jìn)行常規(guī)HE染色，觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞漿為淡紅色，管腔內(nèi)紅細(xì)胞呈橘紅色。組織局部核密集，說(shuō)明細(xì)胞以該位置作為生發(fā)點(diǎn)，不斷增生，向內(nèi)侵襲，形成新的血管腔，小血管明顯增生。

5、 血管瘤組織切片第Ⅷ凝血因子相關(guān)抗原免疫組化結(jié)果顯示，血管瘤周圍小血管明顯增生。 對(duì)制作的組織切片進(jìn)行P53蛋白免疫組化檢測(cè)，比較P53蛋白在組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，血管瘤的瘤體組織較正常組織P53蛋白的表達(dá)增高。 血管瘤瘤體用胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)的細(xì)胞于24h后開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，一周后只有少量細(xì)胞鋪展貼壁生長(zhǎng)，兩周后開(kāi)始生長(zhǎng)分裂，三周后細(xì)胞開(kāi)始快速生長(zhǎng)，四周后，細(xì)胞鋪滿皿底，細(xì)胞總數(shù)為2×105/培養(yǎng)皿

6、。用相差倒置顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)所分離的細(xì)胞呈上皮細(xì)胞形態(tài)。第Ⅷ凝血因子相關(guān)抗原為哺乳動(dòng)物血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子，通過(guò)檢測(cè)該抗原的存在鑒定哺乳動(dòng)物的血管內(nèi)皮細(xì)胞。在激光掃描共聚焦顯微鏡下，觀察到培養(yǎng)細(xì)胞及臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(陽(yáng)性對(duì)照)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)綠色熒光，第Ⅷ凝血因子相關(guān)抗原表達(dá)為陽(yáng)性；A549上皮細(xì)胞(陰性對(duì)照)胞漿內(nèi)無(wú)綠色熒光，第Ⅷ凝血因子相關(guān)抗原表達(dá)為陰性。結(jié)果表明所培養(yǎng)的細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞。 結(jié)論：血管瘤是一種以血管增生為主要特征

7、的良性腫瘤。血管和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞都具有強(qiáng)增殖力，內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)度增殖和異常增殖是產(chǎn)生脈管腫瘤的主要基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)組織學(xué)切片觀察可以看到血管內(nèi)皮細(xì)胞增生并侵入腔內(nèi)，小血管明顯增生，與血管瘤組織學(xué)特征相符。 血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞具有一般腫瘤細(xì)胞所具有的基本特性。與成人正常血管及其內(nèi)皮細(xì)胞相比，血管瘤及其內(nèi)皮細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生化生物學(xué)特征方面存在差異。 從血管瘤瘤體組織分離細(xì)胞，成功培養(yǎng)了血管瘤的內(nèi)皮細(xì)胞，可在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)。分離的細(xì)