人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞特性研究和人海綿狀血管瘤動物模型的建立.pdf

1、血管瘤是最常見的嬰幼兒良性血管增生或血管畸形，好發(fā)于顏面部，常因引起嚴重的面部畸形而影響患者身心健康。盡管血管瘤的形成可能與活躍的血管生成有關，但是其發(fā)病機制還不明了。而且目前對血管瘤的治療尚缺乏安全有效的藥物，因此，研究血管瘤內(nèi)皮細胞的表型和功能特性，并建立一個血管瘤實驗動物模型對血管瘤發(fā)病機制的研究和臨床治療藥物的篩選有非常重要的意義。 目的研究人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞在形態(tài)、表型、功能和基因方面的改變，探索海綿狀血管瘤的發(fā)生

2、機制；建立人海綿狀血管瘤的實驗動物模型，并篩選對海綿狀血管瘤有效的治療藥物。 方法從人海綿狀血管瘤組織分離、純化血管瘤內(nèi)皮細胞。應用免疫熒光染色和流式細胞術鑒定其內(nèi)皮細胞標志性分子的表達。應用透射電子顯微鏡觀察海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞的超微結(jié)構(gòu)的變化；應用流式細胞術和免疫細胞化學方法分析海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞的表型特征；應用Matrigel比較血管瘤內(nèi)皮細胞與正常血管內(nèi)皮細胞形成毛細血管樣網(wǎng)絡能力的差別；應用RT-PCR研究海綿狀血管

3、瘤內(nèi)皮細胞上VEGF及其受體、Ang-1、Ang-2和Tie2的表達。海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞表達和分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶分別通過明膠酶譜法、RT-PCR、Westernblot和細胞免疫熒光染色進行分析。應用酶聯(lián)免疫吸附測定檢查海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞釋放的U-PA、PAI-1和TF。通過將熒光染料標記的血小板與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)比較血管瘤內(nèi)皮細胞和正常內(nèi)皮細胞與血小板粘附能力的差別。此外，應用RT-PCR方法，比較252-基因在血管瘤內(nèi)皮細胞，正

4、常血管內(nèi)皮細胞和腫瘤血管內(nèi)皮細胞的表達差別，并應用透射電子顯微鏡觀察252-基因轉(zhuǎn)染后對人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)異常的影響。 將人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞與腫瘤細胞共同接種于裸鼠皮下，誘導血管瘤模型的形成。通過移植表達綠色熒光蛋白的海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞，并觀察血管瘤模型組織切片中綠色熒光的分布，判斷血管瘤模型中血管內(nèi)皮細胞的來源。另外，通過體外MTT分析，篩選對海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞增殖有抑制作用的藥物，并在血管瘤實驗動物模型評

5、價所篩選藥物對海綿狀血管瘤的療效。 結(jié)果分離的人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞表現(xiàn)單層生長和接觸抑制的特性。透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞內(nèi)有大量的線粒體、異常膨大的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和空泡樣結(jié)構(gòu)。表型分析顯示，人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞表達內(nèi)皮細胞的標志性分子vWF，CD31和HSP，但不表達CD34。與正常人血管內(nèi)皮細胞相比，人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞表達類似水平的兩種TNF受體和ICAM-1，但表達整合素αvβ3分子的水平明顯升高。RT

6、-PCR，酶譜分析和ELISA結(jié)果顯示：人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞具有高表達的內(nèi)源性VEGF和Ang1，Ang2，但VEGF受體和Tie2的表達水平正常，同時與正常血管內(nèi)皮細胞相比，人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞產(chǎn)生大量的酶原形式和激活形式的基質(zhì)金屬蛋白酶，并表現(xiàn)凝血活性和纖溶活性的升高。功能研究發(fā)現(xiàn)，人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞在體外形成與正常血管內(nèi)皮細胞不同的異常血管樣網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，表明海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞在血管生成方面與正常內(nèi)皮細胞不同?；虮磉_研究發(fā)

7、現(xiàn)，252-基因在正常血管內(nèi)皮細胞有表達，在腫瘤血管內(nèi)皮細胞高表達，但是在人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞缺乏252-基因的表達。將構(gòu)建的252基因轉(zhuǎn)入海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞后，有異常膨大內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和空泡樣結(jié)構(gòu)的細胞比例明顯降低。 將海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞與少量腫瘤細胞移植到裸鼠皮下后，可以在細胞移植部位形成類似于血管瘤的結(jié)構(gòu)，組織學檢查發(fā)現(xiàn)形成了較大的血竇，這與人海綿狀血管瘤的病理表現(xiàn)類似。移植表達綠色熒光蛋白的血管瘤內(nèi)皮細胞后，發(fā)現(xiàn)綠色熒光在

8、血管瘤樣組織中沿血管結(jié)構(gòu)分布，說明血管瘤模型中血管內(nèi)皮細胞來源于移植的表達綠色熒光蛋白的人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞。MTT分析發(fā)現(xiàn)一種中藥提取物，876-3對人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞的增殖具有明顯的抑制作用，在血管瘤實驗動物模型進一步證實876-3對實驗性血管瘤具有明顯治療效果。 結(jié)論人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細胞在形態(tài)、表型、功能特性和基因表達上都不同于正常組織起源的血管內(nèi)皮細胞。252-基因表達的缺失可能是導致海綿狀血管瘤發(fā)病的機制，但需