淫羊藿苷增加和動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞促心肌血管新生作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　心肌梗死(MI)是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)多發(fā)病之一，盡管目前應(yīng)用于臨床的許多治療方法已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但仍達(dá)不到令人滿意的效果。以促進(jìn)新生血管來(lái)增加缺血組織灌注的方法，成為治療缺血性心臟疾病的新希望。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)作為內(nèi)皮前體細(xì)胞，可增加血流和毛細(xì)血管密度，促進(jìn)新生血管形成，對(duì)血管再通和修復(fù)起重要作用。當(dāng)機(jī)體發(fā)生組織缺血或血管損傷時(shí)，EPCs從骨髓動(dòng)員進(jìn)入外周血，黏附募集到組織缺血或內(nèi)皮損傷的部位而發(fā)揮

2、作用。但機(jī)體自身靠EPCs對(duì)心肌血管的修復(fù)作用卻是有限的，動(dòng)員骨髓增加外周循環(huán)中EPCs的數(shù)量將成為治療MI類相關(guān)疾病的有效策略。淫羊藿苷(Icariin)是傳統(tǒng)中藥淫羊藿的有效化學(xué)成分之一，可促進(jìn)體外培養(yǎng)的人外周血EPCs增殖，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和心肌損傷具有良好的保護(hù)作用。Icariin對(duì)EPCs具體的生物學(xué)功能影響不清，其是否通過(guò)EPCs促缺血心肌血管新生及具體機(jī)制并不明確。因此，研究Icariin增加和動(dòng)員EPCs促心肌血管新生

3、作用及機(jī)制，將為Icariin在MI類相關(guān)疾病的治療及應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)參考。
　　目的：
　　建立大鼠骨髓來(lái)源的EPCs培養(yǎng)模型，考察Icariin對(duì)體外培養(yǎng)的EPCs增殖、黏附、遷移和血管生成等功能的影響，以及Icariin作用于EPCs相關(guān)信號(hào)通路;研究Icariin對(duì)MI大鼠外周血及骨髓EPCs的作用，探討Icariin對(duì)血管生成和EPCs動(dòng)員的影響和可能機(jī)制。
　　方法：
　　密度梯度離心法分離大鼠

4、骨髓EPCs，應(yīng)用免疫熒光鑒定內(nèi)皮細(xì)胞系列標(biāo)志VEGFR-2、CD34以及祖細(xì)胞標(biāo)志CD133，并通過(guò)檢測(cè)其對(duì)FITC標(biāo)記的凝集素-1(UEA-1)的吸附和內(nèi)吞DiI標(biāo)記低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)來(lái)進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定;觀察體外培養(yǎng)條件Icariin對(duì)EPCs的生長(zhǎng)情況;3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法和5-乙炔基-2'-脫氧尿苷(EDU)法檢測(cè)Icariin對(duì)EPCs增殖的影響;Tran

5、swell法檢測(cè)EPCs的遷移能力;利用EPCs微管形成實(shí)驗(yàn)和雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)考察Icariin對(duì)血管生成的影響。
　　通過(guò)結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支，建立大鼠MI模型，術(shù)后第二天將大鼠隨機(jī)分為Icariin給藥組及對(duì)照組，給藥組連續(xù)給予Icariin28天后，腹主動(dòng)脈取血測(cè)定心肌酶譜、超氧化物歧化酶(SOD)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)含量;分離培養(yǎng)外周血及骨髓單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)后，通過(guò)流式細(xì)胞儀計(jì)

6、數(shù)EPCs，剖取心臟進(jìn)行氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)染色測(cè)量梗死面積，并進(jìn)行心臟組織的HE染色病理檢查;取缺血區(qū)心肌免疫組化法測(cè)毛細(xì)血管及微管密度和EPCs分化情況。
　　結(jié)果：
　　梯度密度離心法分離的單個(gè)核細(xì)胞，特異性表達(dá)抗原CD34、CD133和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR-2)。體外培養(yǎng)的大鼠EPCs生長(zhǎng)增殖旺盛，14天以后細(xì)胞開(kāi)始衰退。EPCs具有對(duì)DiI-ac-LDL攝取和UEA-1結(jié)合特性。MTT法檢測(cè)

7、Icariin對(duì)大鼠EPCs增殖能力顯示，與對(duì)照組相比，Icariin各劑量組均能明顯增加細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖。Icariin5μM、10μM劑量組與對(duì)照組比較，Edu標(biāo)記4h細(xì)胞數(shù)明顯增加;Edu標(biāo)記24h，Icariin各劑量組與對(duì)照組比較，增殖的細(xì)胞數(shù)明顯增多，細(xì)胞增殖率均在75～80％之間。細(xì)胞黏附試驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，Icariin10μM劑量組能增加EPCs的黏附;Icariin各劑量組與對(duì)照組相比，穿過(guò)Transwel

8、l小室膜的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，且穿膜的細(xì)胞數(shù)量隨Icariin劑量的增加而增加，有明顯的量效關(guān)系。經(jīng)細(xì)胞劃痕試驗(yàn)，Icariin各劑量組與對(duì)照組相比，細(xì)胞劃痕間隙明顯變窄。對(duì)EPCs微管形成能力考察顯示，Icariin5μM、10μM劑量組能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的EPCs微管的形成。考察EPCs對(duì)雞胚尿囊膜血管的能力顯示，隨著Icariin劑量的增加，雞胚尿囊膜微血管面積均增多。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time PCR)定量分析表明，Ic

9、ariin5μM、10μM劑量組與對(duì)照組相比，趨化因子受體4(CXCR4)mRNA水甲明顯增加。而Icariin各劑量組與對(duì)照組相比，均能明顯增加磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K) mRNA、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1) mRNA和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS) mRNA的表達(dá)水平，10μM Icariin劑量組的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF) mRNA和SDF-1 mRNA的表達(dá)量升高，明顯高于對(duì)照組。
　　制作在體大鼠心梗模

10、型，連續(xù)給予藥物，心臟組織經(jīng)HE染色病理學(xué)檢查顯示，對(duì)照組大鼠心肌出現(xiàn)明顯陳舊性心梗，而Icariin各給藥組心肌出現(xiàn)不同程度的心梗及炎癥浸潤(rùn)。Icariin各給藥組與模型組比較，梗死面積明顯減少。Icariin能夠降低心肌酶譜中的谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和α-羥丁酸脫氫酶(α-HBD)的水平，而對(duì)乳酸脫氫酶(LDH)、GSH、GSSG和SOD無(wú)影響;Icariin能夠降低血清MDA的含量。I

11、cariin各給藥組能明顯增加外周血中骨髓EPCs相對(duì)數(shù)量，對(duì)骨髓EPCs相對(duì)數(shù)量影響不顯著。免疫組化染色心肌組織切片顯示，Icariin各劑量組與模型組相比，CD133和第Ⅷ因子相關(guān)抗原(vWF)表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加;Icariin5 mg/kg、10 mg/kg劑量組與模型組相比，心肌組織CD34陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量明顯增加。
　　結(jié)論：
　　1.Icariin可促進(jìn)體外培養(yǎng)的EPCs增殖、黏附、遷移和血管生成等功能，其可能的機(jī)