大鼠腔前卵泡體外三維培養(yǎng)系統(tǒng)的建立及其在雌性生殖毒性研究中的應(yīng)用.pdf

1、目前雌性生殖毒性評價方法主要采用整體動物試驗，存在的主要問題是所需動物數(shù)多，不符合3R原則；實驗周期長、所需受試樣品量多，難以滿足化學(xué)品快速發(fā)展的需求；所提供的毒作用機制等信息有限，不足以提供安全性和危險度評定的需求，也不符合現(xiàn)代毒理學(xué)發(fā)展的要求。為此，近幾年國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種體外雌性生殖毒性試驗方法，包括卵巢器官和卵巢皮質(zhì)薄片培養(yǎng)方法和大鼠顆粒細胞和黃體細胞體外毒性試驗法。但這些體外方法無法對卵泡發(fā)育和卵子生成做出客觀評價，而這恰恰

2、是雌性生殖毒性研究的關(guān)鍵所在。因此，迫切需要發(fā)展既能快速檢測雌性生殖毒性又能更好地研究其作用機制的新方法。近年新發(fā)展的體外卵泡培養(yǎng)方法，能對卵巢的主要功能即卵泡發(fā)育、激素生成和卵子發(fā)生進行動態(tài)觀察，可在卵泡不同發(fā)育階段對卵泡每一組分進行分析，對卵泡發(fā)育，卵子發(fā)生和激素調(diào)控等生殖生物學(xué)機制和生殖毒作用機制進行深入研究，因而受到生殖生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和生殖毒理學(xué)等領(lǐng)域的關(guān)注。
　　 我室萬旭英等率先建立了大鼠腔前卵泡體外二維培養(yǎng)模型，

3、但未來體外毒性測試方法的發(fā)展趨勢是發(fā)展基于三維培養(yǎng)模型的方法，目前國外已有小鼠腔前卵泡三維培養(yǎng)模型的報道，但大鼠僅有短期三維培養(yǎng)的報道，尚無大鼠腔前卵泡體外三維完整培養(yǎng)模型的研究報道。
　　 本研究擬在以往研究基礎(chǔ)上，建立一個能支持大鼠腔前卵泡生長并產(chǎn)生成熟卵母細胞又適用于毒性研究的體外三維培養(yǎng)系統(tǒng)；然后用雌性生殖毒物進行驗證研究。目的是為建立一個既可對雌性生殖毒物進行篩選或鑒定，又可對生殖毒作用機制進行研究的體外毒性試驗系統(tǒng)提

4、供依據(jù)。
　　 一、大鼠腔前卵泡體外三維培養(yǎng)系統(tǒng)的建立
　　 目的：建立一個支持大鼠腔前卵泡生長并且能夠產(chǎn)生成熟卵母細胞的體外培養(yǎng)系統(tǒng)。方法：從12-14天齡的雌性SD大鼠卵巢中機械性分離腔前卵泡(140-170μm)，然后在三維的海藻酸鈉和二維的微孔板中連續(xù)培養(yǎng)10天。三維培養(yǎng)效果通過卵泡發(fā)育的形態(tài)學(xué)、激素分泌，排卵率以及卵母細胞成熟率等進行評價，并與二維培養(yǎng)結(jié)果進行比較。結(jié)果：在三維培養(yǎng)期間卵泡一直保持著三維的結(jié)構(gòu)，

5、而在二維培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)兩天后卵泡膜細胞開始貼壁生長，在接下來的培養(yǎng)過程中大部分卵泡的卵泡膜細胞向四周擴散，顆粒細胞突破基底膜。三維培養(yǎng)系統(tǒng)中卵泡的存活率、有腔形成率、COCs排出率以及PB形成率均高于二維培養(yǎng)系統(tǒng)，分別為95.7vs.90.7％(P＜0.05)、72.1vs.33.6％(P＜0.05)、79.3vs.39.8％(P＜0.05)，57.1vs.31.9％(P＜0.05)。在兩種培養(yǎng)系統(tǒng)中，從腔前卵泡到卵母細胞成熟以及第一極

6、體的形成，形態(tài)學(xué)觀察顯示大鼠腔前卵泡體外發(fā)育特征和體內(nèi)相似。雌二醇和孕酮的分泌模式與卵泡的形態(tài)學(xué)變化以及分化情況相一致。結(jié)論：本研究建立的大鼠腔前卵泡體外三維培養(yǎng)系統(tǒng)是成功的。
　　 二、雙酚-A對大鼠卵泡體外生長發(fā)育和卵母細胞成熟的影響
　　 目的：觀察雙酚-A(BPA)對大鼠卵泡體外生長發(fā)育及卵母細胞成熟的影響，驗證該系統(tǒng)用于生殖毒性研究的可行性。方法：從12-14天齡的雌性SD大鼠卵巢中機械性分離腔前卵泡(140-

7、170μm)，隨機分為3個處理組(50～150μM)及一個對照組，然后在三維的海藻酸鈉中連續(xù)培養(yǎng)10天。結(jié)果通過卵泡發(fā)育的形態(tài)學(xué)、激素分泌，排卵率以及卵母細胞成熟率等指標進行評價。結(jié)果：對照組卵泡在連續(xù)的10天培養(yǎng)過程當中，絕大多數(shù)都經(jīng)歷了腔前卵泡、有腔卵泡以及成熟卵泡階段。與對照組相比，隨著劑量的增加卵泡存活率、有腔形成率，COCs排出率以及PB率均降低，100μM及以上劑量下與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。處理組中，卵

8、泡膜細胞和顆粒細胞的增殖受到不同程度的抑制，100μM及以上劑量下與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。雌二醇和孕酮的分泌量隨著劑量的增加而減少，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論：本研究劑量下BPA抑制卵泡的生長和卵母細胞的成熟；初步驗證說明大鼠卵泡體外長期三維培養(yǎng)模型適用于毒性研究。
　　 上述結(jié)果顯示，本研究建立的三維培養(yǎng)系統(tǒng)能夠支持大鼠腔前卵泡生長并產(chǎn)生成熟卵母細胞，而且在卵泡存活率、有腔形成率、