miR-21調(diào)控PTEN和SMAD7調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號通路在二甲雙胍抗血管生成中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的:
　　二甲雙胍（metformin）作為臨床一線的治療Ⅱ型糖尿病的雙胍類口服降糖藥，除具有降糖和保護(hù)心血管作用外，還可通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial cells，ECs）的增殖、遷移以及相關(guān)信號傳導(dǎo)通路，發(fā)揮抗血管生成作用。然而，其具體調(diào)控細(xì)節(jié)及作用機(jī)制還不清楚，有待進(jìn)一步研究和闡釋。microR-21（miR-21）廣泛表達(dá)于多種組織，并且參與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。研究顯示，miR-21通過靶向抑制多種靶基因

2、，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡等功能，在血管生成中扮演著重要的角色。最新研究揭示，二甲雙胍能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中部分miRNA表達(dá)異常，其中二甲雙胍處理可導(dǎo)致miR-21表達(dá)顯著降低，提示是否存在二甲雙胍通過誘導(dǎo)miR-21下調(diào)表達(dá)參與對內(nèi)皮細(xì)胞抑制以及抗血管生成？因此，本文將從miRNA的視角研究二甲雙胍抗血管生成的分子調(diào)控機(jī)制，研究二甲雙胍處理過程中miR-21的上游影響因子和下游靶向調(diào)控因子及其可能調(diào)節(jié)的信號通路，進(jìn)一步查明

3、miR-21介導(dǎo)的對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移能力以及對體外血管生成的影響，從而探討二甲雙胍誘導(dǎo)的miR-21信號通路在血管生成中的作用及機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療心血管類疾病提供新的治療靶點及理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.qRT-PCR研究不同濃度、不同時間點二甲雙胍處理對miR-21表達(dá)的影響；
　　2.“CCK-8法”和“細(xì)胞劃痕實驗”分析二甲雙胍聯(lián)合miR-21模擬物（mimics）、抑制劑（inhibitors）及相

4、應(yīng)陰性對照（NC）處理對HUVECs的增殖、遷移能力的影響，進(jìn)一步應(yīng)用“基質(zhì)膠小管形成實驗”分析對HUVECs體外血管生成的調(diào)節(jié)；
　　3.靶基因生物信息學(xué)預(yù)測miR-21可能的靶基因，并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-21對靶標(biāo)（PTEN和SMAD7）mRNA的結(jié)合位點及作用；
　　4.qRT-PCR和western blot檢測HUVECs中miR-21對靶標(biāo)（PTEN和SMAD7）mRNA和蛋白表達(dá)的調(diào)控；

5、>　　5.結(jié)合二甲雙胍處理和體外干預(yù)miR-21表達(dá)（上調(diào)或下調(diào)），調(diào)查二甲雙胍對上游TGF-β1及下游靶標(biāo) PTEN和 SMAD7表達(dá)以及Akt,RK1/2,SMAD2/3等磷酸化水平的影響，進(jìn)一步利用TGF-β receptor I kinase(TGF-βR1)抑制劑（LY2157299）調(diào)查抑制TGF-β1對miR-21及其靶標(biāo)及下游信號通路的影響，并探討miR-21表達(dá)上調(diào)或下調(diào)對二甲雙胍調(diào)節(jié)的 HUVECs增殖、遷移和體外血

6、管生成的影響，查明具體調(diào)控細(xì)節(jié)并闡釋相關(guān)分子機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.二甲雙胍呈劑量和時間依賴性的下調(diào)HUVECs中miR-21的表達(dá)，濃度為20mM作用24h時下調(diào)最為顯著；
　　2.“CCK-8”法和“細(xì)胞劃痕實驗”結(jié)果表明，二甲雙胍能通過下調(diào)HUVECs中miR-21的表達(dá)進(jìn)而抑制HUVECs的增殖、遷移能力，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，上調(diào)HUVECs miR-21（轉(zhuǎn)染miR-21 mimic）后，二甲雙胍對HUVECs增

7、殖和遷移的抑制效應(yīng)明顯降低；相反的，下調(diào)miR-21（轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor）后，明顯增加二甲雙胍對HUVECs增殖和遷移的抑制效應(yīng)；
　　3.靶基因生物信息學(xué)分析顯示PTEN和SMAD7兩個基因的mRNA3’-UTR存在與miR-21結(jié)合的互補位點；進(jìn)一步熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，miR-21能夠直接靶向調(diào)控PTEN和SMAD7。
　　4.qRT-PCR和western blot結(jié)果顯示，miR-21能顯著上

8、調(diào)HUVECs中靶標(biāo)PTEN和SMAD7 mRNA和蛋白表達(dá)；
　　5.二甲雙胍能通過下調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的miR-21的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致靶標(biāo)PTEN和SMAD7 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，并抑制下游PI3K/Akt,ERK1/2,SMAD2/3等蛋白磷酸化；進(jìn)一步研究結(jié)果表明，上調(diào)HUVECs中miR-21（miR-21mimic）明顯減弱二甲雙胍對Akt,ERK1/2和SMAD2/3蛋白磷酸化的抑制效應(yīng)；相反，下調(diào)miR-21（m

9、iR-21inhibitor）明顯增強二甲雙胍對Akt,ERK1/2和SMAD2/3蛋白磷酸化的抑制效應(yīng)；
　　6.基質(zhì)膠小管形成實驗結(jié)果顯示，二甲雙胍可通過下調(diào)HUVECs中miR-21的表達(dá)抑制其體外小管形成能力，并且上調(diào)HUVECs中miR-21（miR-21 mimic）后，二甲雙胍對HUVECs體外小管形成的抑制效應(yīng)明顯減弱；相反的，下調(diào)miR-21（miR-21 inhibitor）后，二甲雙胍對HUVECs體外小管形

10、成的抑制效應(yīng)顯著增強。
　　結(jié)論：
　　1.二甲雙胍呈劑量和時間依賴性的下調(diào)HUVECs中miR-21的表達(dá)。
　　2.二甲雙胍能通過下調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的HUVECs中miR-21的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致靶標(biāo)PTEN和SMAD7的mRNA和蛋白表達(dá)升高，從而抑制HUVECs中Akt,ERK1/2,SMAD2/3等磷酸化。
　　3.二甲雙胍通過下調(diào)HUVECs中miR-21表達(dá)，進(jìn)而靶向負(fù)調(diào)控其靶標(biāo)及下游相關(guān)信號通路，最

11、終抑制HUVECs的增殖、遷移和小管形成，證實二甲雙胍發(fā)揮抗血管生成作用。
　　4.本研究表明，上調(diào)miR-21的表達(dá)能夠顯著減弱二甲雙胍對HUVECs增殖、遷移能力的抑制效應(yīng)，降低對HUVECs中Akt,ERK1/2和SMAD2/3蛋白磷酸化水平的阻抑，從而阻止二甲雙胍的抗血管生成能力；相反的，下調(diào)miR-21能夠顯著增強二甲雙胍對 HUVECs增殖、遷移的抑制作用，增加對HUVECs中Akt,ERK1/2和SMAD2/3蛋白磷